【摘 要】
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黑曲霉具有极端环境耐受性、食品安全性（GRAS）、较强的蛋白分泌能力、高生产经济性等优点的是生产同源或异源蛋白质的主要工程菌株。NADH的再生和消耗的不平衡以及NADPH的低有效性是黑曲霉中蛋白质高效合成的限制因素之一。NADPH再生酶——苹果酸酶（Mae A）能有效地将NADP+转化为NADPH,提高胞内NADPH的可用性;NAD激酶能直接将NAD+/H转换成NADP+/H,黑曲霉中有三种NAD
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黑曲霉具有极端环境耐受性、食品安全性（GRAS）、较强的蛋白分泌能力、高生产经济性等优点的是生产同源或异源蛋白质的主要工程菌株。NADH的再生和消耗的不平衡以及NADPH的低有效性是黑曲霉中蛋白质高效合成的限制因素之一。NADPH再生酶——苹果酸酶（Mae A）能有效地将NADP+转化为NADPH,提高胞内NADPH的可用性;NAD激酶能直接将NAD+/H转换成NADP+/H,黑曲霉中有三种NAD激酶,两种定位于胞浆中（AN03、AN14）,一种定位于线粒体中（AN17）。本论文以无孢黑曲霉SH-2为宿主,以糖化酶为蛋白生产模型,研究NAD激酶和苹果酸酶的过量表达对黑曲霉中蛋白质合成的影响。通过CRISPR/Cas9编辑技术结合无标记基因整合,提高NAD激酶和苹果酸酶多重表达效率,探究其组合效应对黑曲霉中糖化酶生产的影响,主要研究内容如下:（1）构建通用表达载体和Afpyr G标记的cas9质粒p FC330-amy A,将三种NAD激酶（AN03、AN14、AN17）和苹果酸酶（Mae A）的编码序列克隆到通用表达载体中。在宿主无孢黑曲霉SH-2中,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现NAD激酶和苹果酸酶在Pgpd A启动子控制下的过量表达。NAD激酶（AN03、AN14）的过量表达菌株使胞浆中NAD激酶活性提高了80%,NADP+含量分别增加了40%和68%,NADPH含量分别增加了60%和40%。苹果酸酶（Mae A）的过量表达菌株使胞浆中NADPH含量增加了24%,NADPH/NADP+比值提高2.2倍。NAD激酶（AN17）的过量表达菌株使糖化酶编码基因gla A的转录提高了2倍。与对照相比,三种NAD激酶（AN03、AN14、AN17）和苹果酸酶（Mae A）的过量表达重组菌株使得糖化酶活性分别提高了约70%,50%,90%,70%,分泌总蛋白分别增加了约25%,22%,52%,26%。（2）通过CRISPR/Cas9编辑技术结合无标记基因整合技术实现NAD激酶和苹果酸酶单基因过量表达,再通过回收过量表达苹果酸酶（Mae A）的重组菌株OEmae A中游离的cas9质粒p FC330-amy A,能够快速实现无标记的基因整合事件,得到二次转化宿主OEmae A-R,提高NAD激酶和苹果酸酶的多重遗传改造效率,便于进一步研究NAD激酶和苹果酸酶的多重遗传操作累积效应对黑曲霉中糖化酶生产的影响。（3）将候选基因AN03、AN17和mae A克隆到Ptef启动子控制下的通用表达载体中,线性化片段与hyg B标记的cas9质粒p FC332-aam A共转至OEmae A-R菌株中,得到双基因表达菌株。与对照菌株相比,额外引入一个苹果酸酶编码基因mae A的菌株OEmm,尽管mae A转录水平提高了,但是糖化酶酶活和总蛋白水平没有明显变化。AN03和mae A的组合菌株OEm03使NADP+和NADPH分别增加了20%和40%,但是糖化酶酶活和总蛋白水平分别下降了约12%和10%。AN17和mae A的组合菌株OEm17使糖化酶酶活进一步提高了约19%,总蛋白水平没有明显的变化。
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