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大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率，给社会造成了沉重的负担。恶性肿瘤细胞粘附作用的减弱和缺失是导致肿瘤侵袭转移的重要原因。转化生长因子β/Smad(Transforming growth factor-β，TGF-β)信号转导通路在大肠癌的发展，演变及侵袭转移中起到重要的作用。Smad4作为一个肿瘤抑制基因是该信号通路的中心分子。本研究通过RNA干扰技术特定抑制Smad4蛋白在大肠癌细胞中的表达，并观察其对粘附作用的影响，来探讨大肠癌细胞的侵袭转移机制，为临床治疗提供理论依据。
实验方法：
1、Smad4-shRNA表达质粒的构建:参考相关文献，使用Ambion公司的在线设计软件，合成了能够编码Smad4基因的小发夹RNA(Smad4-shRNA)的DNA模板，并将其插入到pSliencerTM4.1-CMV neo表达质粒中，得到pSliencerTM4.1-CMV-Smad4-shRNA重组质粒;然后将该重组质粒转化到Ecoli感受态细胞中，通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆并进行扩增;通过PCR及基因测序筛选出正确插入的Smad4-shRNA表达质粒;
2、HCT-116-Smad4-RNAi细胞模型的建立:应用碱裂解法提取质粒，脂质体转染法转染人大肠癌HCT116细胞，western blot法检测Smad4基因的沉默效果;
3、相关指标检测:采用western blot法检测Smad4基因沉默前后MMP2，MMP9表达的变化;流式细胞仪检测细胞周期、凋亡的变化;细胞计数法检测细胞的增殖力，Transwell法检测Smad4基因沉默前后细胞侵袭能力的变化。
实验结果
1、Smad4-shRNA表达质粒的成功构建:含有重组质粒的阳性克隆菌液PCR扩增片段约为250bp，并且其基因测序结果显示插入片段碱基排列顺序正确，说明Smad4-shRNA表达质粒构建成功;EGFP证明转染效率约为70～80％。
2、成功建立HCT-116-Smad4-RNAi细胞模型:与对照组相比，转染Smad4-shRNA质粒24、48和72小时后，Smad4基因的蛋白表达水平均明显降低(P＜0.05)。说明Smad4基因沉默，HCT-116-Smad4-RNAi细胞模型成功建立。
3、Smad4基因沉默对人结直肠癌HCT-116细胞增殖力，周期、凋亡以及侵袭力的影响:与对照组相比，Smad4基因沉默后细胞的增殖力明显增强，且S期细胞增多，早期凋亡的比例明显降低。同时Transwell可见HCT-116细胞的侵袭作用较对照组明显增强(P＜0.05)。
4、Smad4基因沉默对人结直肠癌HCT-116细胞中MMP2，MMP9表达的影响:与阴性对照组相比，转染48和72小时后，HCT-116细胞中MMP2，MMP9的蛋白表达水平均明显增加(P＜0.05)。
结论：
1、Smad4基因沉默可增强HCT116细胞的增殖以及侵袭能力。
2、Smad4基因沉默可使HCT116细胞阻滞在S期，并降低了早期凋亡率。
3、Smad4基因沉默可使基质金属蛋白酶MMP2及MMP9的表达增加。
4、Smad4基因可能是大肠癌细胞侵袭转移机制中的关键因子。
5、在大肠癌细胞侵袭转移调控机制中，MMP2、MMP9可能是Smad4基因的下游调控因子。