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植物胞质分裂的特征是在细胞分裂面形成细胞板膜结构。SNARE蛋白介导的膜融合促进细胞板的形成以及细胞板成熟形成新的细胞膜(壁)。在膜融合过程中,定位在靶膜上的t-SNARE蛋白和定位在囊泡膜的R—SNARE蛋白装配形成有功能的SNARE复合体。近年来,在模式植物拟南芥中,只有少数研究报道了几个定位到细胞板的t-SNARE蛋白参与胞质分裂过程中的膜融合。然而,参与细胞板形成的SNARE复合体中有关R—SNARE蛋白却知之甚少。
本文对拟南芥两个序列同源相近的R-SNARE蛋白VAMP721和VAMP722在胞质分裂细胞板形成过程中的功能进行了研究。首先,我们构建了内源启动子驱动的N端GFP或mCherry标记的VAMP721和VAMP722融合蛋白来确定它们的亚细胞定位。通过囊泡转运抑制剂处理和与细胞器标记蛋白共定位分析表明,荧光蛋白标记的VAMP721和VAMP722定位在根尖细胞内的反面高尔基体管网(TGN)-早期内涵体,而不定位到高尔基体和前液泡体,同时FM4-64的早期内吞标记模式也验证了这一结果。VAMP721和VAMP722的单突变体和杂合双突变体植株的生长发育与野生型类似,但值得注意的是,通过基因型和RT-PCR检测发现,从杂合双突变体自交后代中分离鉴定出纯合双突变体幼苗。vamp721vamp722突变体萌发两天后即停止生长,其中根、胚轴和子叶发育迟缓,幼苗只能存活10天左右。将内源启动子驱动的GFP-VAMP721载体整合到vamp721-/-vamp722+/-植株,互补了纯合双突变体致死的表型。此外,通过杂交的方法,我们还获得了分别表达质膜和液泡膜标记蛋白的纯合双突变体。荧光定位结果显示,质膜标记蛋白在vamp721vamp722突变体胞质内异常聚集,几乎不定位在质膜上,而液泡膜标记蛋白则能正常定位,由此表明,VAMP721和VAMP722介导了运输到质膜的后高尔基体蛋白转运。为了进一步研究VAMP721和VAMP722的功能,通过半薄切片观察对比野生型和纯合双突变体根细胞结构发现,vamp721vamp722突变体根细胞轮廓不规则,并产生截短和残缺的细胞壁。用荧光增白剂和碘化丙啶同时标记细胞壁和细胞核后统计表明,纯合双突变体中高达34.2％的根细胞为双核细胞,19.0％的根细胞存在不完整的细胞壁,然而野生型根细胞中相应表型的比例分别只有1.3％和0.9％。此外,vamp721vamp722突变体子叶表皮细胞中也产生了截短的细胞壁,纯合双突变体还抑制了细胞板的延伸。在根尖和子叶表皮的分裂细胞中,GFP-VAMP721和GFP-VAMP722主要定位在延伸中的细胞板和胞质分裂后的细胞膜.通过对细胞板形成过程的追踪观察,我们发现GFP标记的VAMP721和VAMP722在胞质分裂中表现出类似的亚细胞定位,即较强的GFP荧光信号主要分布于正在形成中的细胞板上,当细胞板与母细胞膜融合后,GFP荧光信号则逐渐减弱。此外,应用ConcA处理后,可导致GFP-VAMP721和GFP-VAMP722标记的内涵体发生聚集,并在根尖分裂细胞中,经标记的细胞板形态异常,扭曲变形,厚度不均。同样,在ConcA处理的表达细胞板特异标记蛋白GFP-KNOLLE的细胞中,我们也得到了类似的结果。上述结果暗示,VAMP721和VAMP722标记的从TGN分选的囊泡和内涵体参与胞质分裂细胞板的构建。根据荧光蛋白标记的细胞板,我们对vamp721vamp722突变体(表达GFP-KNOLLE)、对照(GFP-KNOLLE幼苗)以及功能互补的纯合双突变体(表达GFP—VAMP721)的根尖分裂细胞中细胞板形成表型分别进行统计,结果显示,纯合双突变体中高达41.8％的细胞板形态异常,10.9％的细胞板非对称性延伸。然而,在对照和功能互补的纯合双突变体中,超过90％的细胞板形态正常。由此可见,功能互补的纯合双突变体植株其正常生长很可能是由于胞质分裂恢复