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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)和猪呼吸道疾病综合征(PRDC)等多种疾病的主要病原,在猪群中广泛存在。PCV2感染可以造成免疫抑制,引起其他各种病原的继发感染,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。疫苗预防是当前PCV2防制的主要举措之一。灭活疫苗与亚单位疫苗是早期研究的疫苗,由于灭活疫苗与亚单位疫苗成本高、需要多次免疫等缺点,因此,开发廉价、高效和安全的新型疫苗成为人们研究的热点。PCV2含有两个主要的开放阅读框(ORF1,ORF2),ORF2编码病毒的衣壳(Cap)蛋白。Cap蛋白是病毒的结构蛋白,同时也是病毒的主要免疫原性蛋白。本研究利用杆状病毒双表达系统构建两个重组杆状病毒,表达的外源基因分别是PCV2缺失核定位信号衣壳蛋白(Nuclear localization signal-defected capsid protein,dCap)和部分缺失核定位信号衣壳蛋白(Nuclear localization signal-partial defected capsidprotein,pdCap),并对表达蛋白的免疫原性进行分析。研究取得如下结果:
1利用PCR方法扩增dCap和pdCap基因,将其分别亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1的gp64信号肽和gp64成熟蛋白之间。将融合片段再次亚克隆到质粒pcDNA3.1(+)上,获得重组质粒。然后将含有CMV启动子,gp64及dCap佃dCap基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBac-V,得到重组转移质粒pFastBac-dCap/pdCap-V。然后将此转化DH10Bac感受态细胞,获得的重组穿梭质粒,经脂质体转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒Ac-Dual-dCap,Ac-Dual-pdCap。重组病毒感染Sf9细胞后可以产生典型的细胞病变,转导哺乳动物细胞后经间接免疫荧光试验证明,重组杆状病毒成功转导哺乳动物细胞。通过Western blotting分析,重组杆状病毒中表达了dCap和pdCap蛋白。
2将Ac-Dual-dCap,Ac-Dual-pdCap免疫BALB/c小鼠,以注射Ac-V-Cap的小鼠作为阳性对照组,以注射:PBS的小鼠作为阴性对照组,以注射Ac-WT的小鼠作为杆状病毒野毒对照。试验结果表明,在首免后第三周,重组病毒Ac-Dual-dCap,Ac-Dual-pdCap免疫组均可检测到较高水平的ELISA抗体,加强免疫之后,Ac-Dual-dCap,Ac-Dual-pdCap免疫组ELISA平均抗体滴度分别能达到1:11520和1:10240左右,而平均中和抗体水平分别达到1:28和1:26,显著的高于其它免疫组。首免后第9周免疫组仍保持较高的ELISA抗体和中和抗体水平。以上结果证明本研究所制备的重组杆状病毒具有较好的免疫原性,有望成为一种PCV2新型疫苗。