ADAMs相关基因的克隆表达及功能分析

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目的:  构建去分化处理的常氏肝癌细胞的cDNA文库,免疫筛选并克隆与分化相关的ADAMs基因,并初步研究其功能。  方法:  1.Western blot方法检测DM(去分化培养基)处理的常氏肝癌细胞中蛋白表达的变化。  2.构建DM处理的常氏肝癌细胞cDNA文库。  3.用通用抗体对文库进行免疫筛选,克隆基因全长并测序分析。  4.构建ARP1的原核表达载体,用SDS-PAGE和Western blot方法分析ARP1的功能。  5.为了了解ADAMs组织器官分布和蛋白水解酶活性,分析大鼠的包括肝在内的17种组织器官的ADAMs的组成及蛋白图谱和蛋白水解酶谱。  结果:  1.相对于正常常氏肝癌细胞,DM处理的常氏肝癌细胞出现了30kD、50kD和105kD三种ADAMs。其中30kD和50kD ADAMs为DM所诱导。  2.经检测,成功构建了DM处理的常氏肝癌细胞的cDNA文库。  3.用ADAMs通用抗体对文库进行了免疫筛选和基因全长克隆,测序分析并注册了4个物种特异性的与ADAMs相关的基因。  4.成功构建了ADAM相关基因1(ARP1)的原核表达载体,用活性电泳、Western blot方法分析发现,ARP1表达产物具有偏碱性蛋白水解酶活性,可降解明胶,并且可以和ADAMs通用抗体结合。  5.通过分析不同组织器官的ADAMs的分布及蛋白图谱和蛋白水解酶谱,结果显示ADAMs的分布及酶活具有很大差异。  结论:  本研究通过DM处理常氏肝癌细胞,构建cDNA文库并进行表达文库免疫筛选等方法,初步验证了DM处理可以诱导常氏肝癌细胞合成30kD和50kD ADAMs;构建的cDNA文库质量达标,可用性强;建立了切实可行的表达文库免疫筛选方法;注册了4个物种特异性的与ADAMs相关基因;构建了ADAMs相关基因1(ARP1)的原核表达载体,表达产物具有偏碱性蛋白水解酶活性,可以和ADAMs通用抗体结合。在不同组织器官中,ADAMs的分布及酶活具有很大差异。以上结果为进一步研究ADAMs及其相关基因的功能提供了重要资料。
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