坛紫菜受高温和干出胁迫的机理及脂代谢关键基因的研究

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坛紫菜生命周期中包括了叶状体和丝状体两种生活时期,高温和干出胁迫是坛紫菜养殖过程中不可避免的逆境。35℃高温热激胁迫30min后,我们对坛紫菜中脂肪酸和挥发性物质,超氧化物歧化酶、NADPH氧化酶活性、H2O2含量,红藻糖苷含量进行了测定,并对热激蛋白70(hsp70),NADPH氧化酶(rboh)基因进行了定量分析。结果表明:在常温下,丝状体中H2O2和脂肪酸衍生物含量,Phrboh和Phhsp70基因拷贝数,NADPH氧化酶活性和红藻糖苷含量均明显高于叶状体。热激后,叶状体中H2O2含量,Phrboh和Phhsp70基因表达量,NADPH氧化酶活性以及红藻糖苷含量均显著增加。丝状体中饱和脂肪酸显著增加,多不饱和脂肪酸减少,8-碳挥发物出现积累。然而,H2O2含量,氧爆发相关基因和酶均没有明显表达。此外,干出胁迫坛紫菜叶状体4h后,对藻体细胞的超微结构观察发现细胞形态出现了明显的变化,细胞失水率高达98%,并出现部分膜损伤。干出胁迫后,作为参与渗透压调节和细胞壁合成的红藻糖苷含量显著升高,同时合成红藻糖苷前体物质的甘油激酶(nho1)和3-磷酸甘油脱氢酶(gpdh)基因也均出现了上调表达。挥发性物质含量和种类较干出前均有较大的变化,参与合成挥发性物质的脂氧合酶(lox1,lox2)基因均有显著上调表达。脂氧合酶是一类具有调解激素和防御性物质生成的关键酶。本研究从坛紫菜叶状体中克隆得到一条与防御相关的基因(Phlox2),该基因编码表达一个脂氧合酶,Phlox2完整ORF为2700bp,编码899个氨基酸的蛋白。该蛋白有两个功能域(SRPBCC超家族功能域和LOX功能域)组成。系统发育树分析表明,红藻LOXs在进化早期已经形成一个独立的分支。PhLOX2是一个多功能酶,同时具有脂氧合酶和氢过氧化物酶两种活性,它具有底物广谱性和氧化位点的多样性。它可以催化多种不饱和脂肪酸,包括了C18到C22,生成包括单过氧化,双过氧化和单羟基产物,但对C20不饱和脂肪酸具有偏好性,简言之,以γ-亚麻酸为底物时,PhLOX2具有6-/9-/10-LOX活性;以花生四烯酸为底物时,具有5-/8-/11-LOX活性;以二十碳五烯酸为底物时,具有5-/8-/11-/14-LOX活性;以二十碳六烯酸为底物时,具有4-/7-/8-/13-/16-LOX活性。PhLOX2催化的底物需含有三重烯键,羟基化产物的催化位点位于第二个和第三个双键之间的碳原子上,而双过氧化产物的生成是分两步完成的。综上所述,热激时丝状体与叶状体具有不同的适应机制。而处于干出胁迫时,坛紫菜中红藻糖苷的累积,ROS的产生,以及挥发性物质的生成,这些生理反应与坛紫菜所具有极端耐旱性必有关联。本课题为藻类抗逆机制的研究提供实验基础。
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