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作为mRNA和蛋白质之间信息传递的衔接分子,tRNA在蛋白质合成过程中扮演着极其重要的角色。在所有生物中,tRNA都是以前体的形式被转录的,这些前体tRNA都含有5’和3’端延伸序列,且在形成功能分子之前必须被切除。为了产生成熟的tRNA分子,前体tRNA必须经历一系列加工过程,包括由核酸内切酶和核酸外切酶执行的3’末端加工。在许多细菌、大多数古细菌及所有真核生物中,tRNA基因都不编码3’末端CCA序列,这种情况下,前体tRNA的3’末端加工由核酸内切酶tRNase Z催化完成。tRNase Z有短型(tRNase ZS)和长型(tRNase ZL)两种形式,人的tRNase ZL基因ELAC2是作为前列腺癌易感基因首先被发现的。粟酒裂殖酵母(Schizosaccharo-myces pombe)中有两个tRNase ZL基因分别为sptrz1+和sptrz2+。本研究即以粟酒裂殖酵母为模式生物,研究其pre-tRNA3’末端加工酶tRNase Z(SpTrz1p、SpTrz2p)的体内和体外功能。为促进人们对因pre-tRNA3’末端的加工缺陷引起的各种疾病的理解提供帮助。主要研究结果如下:
1.首先构建了粟酒裂殖酵母tRNase Z相关蛋白的表达载体pESP2-trz1、pESP2-trz1(H574A)、pESP2-Δ38trz2、pESP2-Δ38trz2(D476A)、pESP2-trz2,并表达纯化了相应的GST重组蛋白SpTrz1p、SpTrz1p(H574A)、Δ3sSpTrz2p、Δ38SpTrz2p D476A)、SpTrz2p,为下一步体外功能的研究奠定了基础。
2.通过体外转录的方法获得放射性标记的人pre—tRNAArg产物,再以此为底物,进行了SpTrz1p、SpTrz2p及相关变体的pre-tRNA3’末端加工酶活性的研究。研究结果表明,SpTrz1p在体外具有pre-tRNA3’末端加工酶活性,pre-tRNAArg被加工成大小约73nt和18nt的两个片段,且加工位点位于pre-tRNAArg的3’末端；与此相反,SpTrz1p(H574A)不具pre-tRNA3’末端加工酶活性。实验结果还表明,Δ38SpTrz2p和SpTrz2p同时具有pre—tRNA3’末端加工酶活性,但在相同条件下,Δ38SpTrz2p对pre-tRNA底物3’末端加工效率比SpTrz2p明显要高；十分意外的是,突变体蛋白Δ38SpTrz2p(D476A)也具有很强的pre-tRNA3’末端加工酶活性,却不能得到完整的3’端延伸序列。
3.构建了SpTrz2p的低表达和高表达两类载体,并且对SpTrz2p分别进行了N端或C端Flag标记；再将这些SpTrz2p表达载体分别转化sptrz2⊿∷his3+双倍体菌株,进行孢子形成和单倍体质粒救活分析。研究结果表明,SpTrz2p的低表达质粒和高表达质粒对sptrz2⊿∷his3+单倍体菌株都有质粒救活作用,但SpTrz2p的N端Flag标签和C端Flag标签都会影响SpTrz2p的生物学功能,导致其对sptrz2⊿∷his3+单倍体菌株救活率都远低于50％；并且在低表达时,N端Flag标签对SpTrz2p的体内功能影响更大,载体对单倍体菌株救活率更低:而在高表达时,C端Flag标签对SpTrz2p的体内功能影响更大,载体对单倍体菌株救活率更低。sptrz2⊿∷his3+单倍体菌株的Flag标签质粒救活作用得到了质粒穿梭实验的验证。
4.构建了含sptrz2+启动子上、下游同源片段的质粒pAF1-trz2pupdown,并通过对质粒pAF1-trz2pupdown进行酶切,获得了trz2p的同源敲除片段；通过同源重组的方法获得了trz2p∷nmt1**型菌株。但平板培养结果显示,thiamine的添加对trz2p∷nmt1**型菌株的生长没有影响,表明SpTrz2p的表达无法被完全关闭,微量的本底表达即可满足其正常生长的需要。