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多糖在自然界分布极广,广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中,是构成生命的三大基本物质之一。多糖不仅是结构和能量物质,还直接参与细胞的分裂过程,调节细胞生长。研究发现,多糖在抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗溃疡、抗突变、降血脂、降血糖等方面具有医疗保健作用。本论文对广西特有或主要分布的金花茶、滇桂艾纳香和麻风树这三种植物,进行多糖提取、纯化、结构分析研究。
1.对金花茶多糖的研究
(1)为优化金花茶叶的多糖超声波辅助提取工艺,在单因素实验的基础上,选取料液比、提取温度和时间三因素为自变量,多糖提取得率为响应值,应用DesignExpert8.2软件技术,采用响应曲面法设计、分析研究各自变量及其交互作用对多糖得率的影响。利用响应面分析法,模拟得到二次多项式回归方程的预测模型,并确定金花茶叶多糖超声波辅助提取工艺的最佳条件为:料液比1:46.0,提取温度87.0℃,提取时间54.0min。在此条件下,多糖提取得率为4.10％。提取三因素对多糖提取得率影响顺序是:提取温度＞料液比＞提取时间。检测表明,金花茶干叶多糖含量为1.76％。
(2)对金花茶花的多糖采用了微波和超声波辅助提取工艺,运用响应面分析法对工艺进行优化,得出微波最佳条件是:料液比1:29.0,提取温度85.0℃,提取时间12.0min,提取得率为3.886％:超声波最佳条件是:料液比1:34.0,提取温度76.0℃,提取时间32.0min,提取得率为3.479％。两工艺比较得出微波提取工艺优于超声波。多糖含量检测,用超声波辅助提取,多糖含量为1.97％;微波辅助提取为2.14％。
(3)对金花茶叶多糖进行了结构表征。先对金花茶多糖提取液用膜分离,选取被膜截留分子量≥100Kda的多糖液为研究对象,用Sevag法反复脱蛋白,活性碳粉末脱色,活水透析,DEAE.纤维素柱粗分,再用琼脂糖凝胶Sepharose6F.F反复柱层析纯化,经凝胶渗透色谱仪检测,得到三个纯化组分,分别是CTLP-1、CTLP-2和CTLP-3,其Mp分别为1.054×100、8.312×105、8.997×105Da.
(4)对纯化组分CTLP-2先进行了酸水解和HPLC分析,其单糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖组成,摩尔比为2.12:1.96:4.02;然后进行甲基化、部分酸水解、高碘酸氧化和Smith降解,结合NMR和IR光谱分析,发现CTLP-2的主链由-3)-Gal-(1-和-3,6)-Gal-(1-残基组成,侧链由-)α-L-Araf-(3→1)-α-L-Araf和-1)-β-Rha-(3→1)-α-Rha分别连在α-D-Gal-(1→残基的C6位O上,因此得出了CTLP-2的化学结构式。
2.对滇桂艾纳香多糖的研究(1)对滇桂艾纳香多糖的提取,在微波辅助提取单因素试验基础上,应用响应面分析法研究了微波提取温度、时间和料液比三因素对多糖提取得率的影响,得出最佳提取工艺条件是:提取温度75.0℃,提取时间11.0min和料液比1:37.0,提取得率2.46％;提取三因素对多糖提取的影响顺序是:提取温度＞料液比＞提取时间。检测表明,滇桂艾纳香干全草多糖含量为0.876％。
(2)选取滇桂艾纳香粗多糖被有机膜(截留分子量段1～10Kda)截留所得粗多糖渗透液部分,作为纯化研究对象。先用三氯乙酸和Sevag法相结合脱蛋白,然后用S-8大孔树脂和Al2O3柱层析先后脱色处理,再过DEAE-纤维素柱分离,用0.15,0.3和0.5MNaCl溶液洗脱粗分,最后用琼脂糖凝胶Sepharose6EE反复柱层析纯化,纯化出BRP-1、BRP-2、BRP-3、BRP-4、BRP-5这5个组分,它们的Mp分别为1352、7553、8619、11592、5840Da.
(3)对纯化组分BRP-1、BRP-5进行酸水解,经GC-MS分析其单糖组分和摩尔分数比,并用飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)对BRP-1分子质谱分析,得出BRP-1分子量为1314:然后对BRP-1、BRP-5甲基化分析,结合BRP-1、BRP-5的(1D、2D)NMR图谱分析,阐明了它们的化学结构。
3.对麻风树多糖的研究
(1)用四种不同工艺对麻风树叶多糖提取进行了比较,得出微波辅助提取工艺最好,多糖提取得率为6.22％,超声波次之,提取得率为5.32％,新工艺“原料湿润-微波辐射-浸提”,其提取得率为4.93％,但生产量大,传统水提取得率仅为3.43％;微波和超声波辅助提取工艺的提取三因素对多糖提取得率的影响大小是:微波辅助提取,料液比＞提取温度＞提取时间;超声波辅助提取,提取温度＞料液比＞提取时间。四种不同提取工艺对麻风树干叶多糖含量测定各不相同,传统水提为0.878％;微波辐射为1.233％;微波提取为1.555％;超声波提取为1.333％。
(2)对粗多糖分离纯化时,先进行膜分离,即先过陶瓷膜(截留分子量100Kda),再过两次有机膜(10Kda和1Kda)分离,粗多糖液被分成4个部分。
(3)对截留分子量≥100Kda粗多糖,进行脱蛋白和脱色预处理后,先过DEAE-纤维素粗分,再经Sepharose6F.F反复柱层析纯化,得到两个纯化组分JLP-3-1和JLP-3-2,经凝胶渗透色谱HPGPC检测,为均多糖组分,Mp分别为1.6512×106和1.0708×106Da;经酸水解,HPLC检测分析,其所含单糖组分同为为鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖,其单糖摩尔比则是:JLP-3-1为0.976:2.103:3.852;JLP-3-2为0.982:1.091:3.894。