论文部分内容阅读
目前治疗病态窦房结综合征、房室传导阻滞等缓慢型心率失常的主要方法仍是安装心脏电子起搏器，但心脏电子起搏器存在的诸多缺陷限制了它的应用，因此心脏生物起搏器构建已经成为生物起搏研究的热点。当前心脏生物起搏器的构建方法主要有基因治疗、细胞移植和组织工程化构建等方法。基因治疗存在外源基因难以在体内长期稳定表达和有效调控，缺乏高效、安全、导向性好的载体等问题。细胞移植和组织工程化构建可以较好的避免基因转染的缺点。而细胞移植和组织工程化构建都涉及到种子细胞的问题。目前用于心脏生物起搏器研究较多的种子细胞为：胚胎干细胞（embryonic stemcells, ESCs）、诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）、心脏来源的细胞、骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）等，这些种子细胞都存在一定的缺陷，因此寻找更合适的种子细胞仍是心脏生物起搏器构建的瓶颈问题。去分化脂肪（dedifferentation fat，DFAT）细胞由于其易获得、多向分化潜能及自体可取得优势，已经引起许多研究学者的注意。DFAT细胞是由成熟脂肪细胞逐渐脱脂去分化而成，具有间充质干细胞的表型，而且具有多向分化潜能，在体外可以分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞和神经细胞等。Jumabay等在对小鼠DFAT细胞给予20%胎牛血清诱导培养14天后，即可出现一些自发跳动的心肌样细胞，具有起搏细胞的4期自动除极化的电生理特征，为构建心脏生物起搏器带来了新的希望。但是由于小鼠心脏太小，难以进行心脏生物起搏器的在体研究。因此，有必要对更大型动物进行研究。但用与心肌细胞共培养等方法诱导大鼠DFAT细胞，细胞表达心肌细胞的表面标志，有肌管样结构形成，可并未观察到有细胞具有自主搏动。因此，能否将大鼠等来源的DFAT细胞诱导为起搏细胞还需要进一步的探讨。本实验拟选用大鼠来源的DFAT细胞为种子细胞，采用5-AZA诱导和与窦房结细胞共培养的方法，探讨能否在体外诱导DFAT细胞分化为起搏样细胞，旨在为心脏生物起搏器的构建提供一种来源广泛、可来源于自体、无免疫排斥反应，且活性好的种子细胞。第一部分DFAT细胞的分离、培养和鉴定研究目的：分离培养获得大鼠DFAT细胞，并进行鉴定，以获取可向起搏样细胞诱导分化的种子细胞。材料和方法：经胶原酶消化获得的成熟脂肪细胞，经天花板培养法使成熟脂肪细胞去分化，观察去分化过程细胞形态的变化，用透射电镜检测细胞的超微结构。取生长良好的DFAT细胞做免疫细胞化学检测CD13、CD29、CD31、CD34和CD44的表达情况，并对DFAT细胞进行成脂诱导分化和成骨诱导分化以检测DFAT细胞的多向分化潜能。结果：成熟脂肪细胞可以在天花板培养的条件下去分化为成纤维样的DFAT细胞，透射电镜结果显示细胞内含丰富的高尔基体和内质网，说明细胞具有较强的蛋白合成能力，细胞活力旺盛。经免疫细胞化学检测，DFAT细胞表达CD13、CD29、CD44，不表达CD31和CD34，具有一定的间充质干细特性。体外多向分化潜能结果显示，成脂诱导后油红O染色可见红色脂滴；成骨诱导后茜素红染色可见钙盐沉积，证明获得的DFAT细胞具有多向分化潜能。结论：通过天花板培养法成功分离、培养了DFAT细胞。第二部分5-AZA对DFAT细胞的诱导分化研究目的：探讨5-AZA诱导DFAT细胞分化为起搏样细胞的可能性。材料与方法：用10μmol/L的5-AZA诱导DFAT细胞，分别在1周、2周、3周用PCR检测诱导后细胞中起搏相关基因的表达；在3周时免疫细胞化学检测起搏相关标志物的表达；利用与静息心室肌共培养的方法，检测其起搏功能。结果：DFAT细胞经5-AZA诱导后细胞变大，突起增多，诱导后3周透射电镜下可见有肌节样结构和较多的缝隙连接。诱导后细胞心脏早期标志基因Nkx2.5、GATA-4先上调后下降，Tn、Cx和HCN基因随着诱导时间的延长表达逐渐升高，免疫细胞化学显示诱导后细胞可表达心肌肌钙蛋白TnT和TnI，缝隙连接蛋白Cx43和Cx45，以及起搏通道蛋白HCN2、HCN4。与静息心室肌共培养发现经5-AZA诱导的DFAT细胞并不能驱动静息的心室肌搏动。结论：5-AZA可以诱导DFAT分化为具有一定起搏细胞表型的细胞，但并不具备起搏细胞的功能。第三部分与窦房结细胞共培养对DFAT的诱导分化研究目的：探讨与窦房结细胞共培养诱导DFAT细胞分化为起搏样细胞的可能性。材料与方法：用差速贴壁结合BrdU法分离新生鼠窦房结细胞，再接种于Transwell小室内，在6孔培养板中接种DFAT细胞，最后将Transwell小室插入6孔板中，使DFAT细胞与窦房结细胞间接接触共培养，分别在1周、2周、3周用PCR检测相关基因的表达；在诱导3周时用免疫细胞化学检测相关蛋白的表达；利用与静息心肌共培养的方法，检测其起搏功能。结果：经与窦房结细胞共培养后，DFAT细胞逐渐变大，可见肌管样细胞，透射电镜下可见明显肌节结构，且存在较丰富的细胞间连接，在与窦房结细胞共培养过程中，诱导后细胞心脏早期标志基因Nkx2.5、GATA-4先上调后下降，Tn、Cx和HCN基因随着诱导时间的延长表达逐渐升高，免疫细胞化学显示诱导后细胞表达心肌肌钙蛋白TnT和TnI，缝隙连接蛋白Cx43和Cx45，以及起搏通道蛋白HCN2、HCN4。与静息心室肌共培养发现与窦房结细胞共培养的DFAT细胞可以驱动静息的心室肌搏动。结论：与窦房结细胞共培养可以将DFAT细胞诱导分化为具有一定起搏细胞表型和功能的起搏样细胞。