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DNA的精确复制是维持遗传物质稳定的必要条件。在DNA复制过程中，一些内源和外源的刺激会导致DNA复制叉(replication fork)的停滞，引起DNA复制压力反应(DNA replication stress response，DRSR)。在人体中，复制压力反应的缺陷会造成基因组的不稳定，引发癌症和很多遗传疾病。可变剪接是在转录后水平(post-transcription)精密调控基因表达的生物学过程。可变剪接使真核生物的基因组表达出种类更为繁多的蛋白，从而极大地增加了蛋白组的复杂性和多样性。深度测序研究表明，诸多参与DRSR的功能基因都至少产生两个转录本，这暗示可变剪接可能参与调控DRSR，但其中的作用方式和具体机制还不清楚。作为Prp19复合体的核心组分之一，BCAS2(breast carcinoma amplified sequence2)参与前体mRNA的剪接等重要生物学过程。本课题拟用Bcas2诱导性敲除的细胞系为模型，研究和探讨可变剪接与DNA复制压力反应之间的联系。 我们的研究结果表明，BCAS2对维持细胞基因组的稳定性是必需的。在真核生物中，基因组的稳定性主要依赖于两个因素:精确的DNA复制和高效的DNA损伤修复。我们的研究发现，BCAS2的缺失影响了DNA损伤修复信号通路，使DNA损伤不能被及时修复。为了研究BCAS2是否参与调控DRSR，探究BCAS2的缺失是否会影响停滞复制叉(stalled replication fork)上新合成DNA链的稳定，以及停滞复制叉的重新起始。实验结果表明，BCAS2不仅定位在复制叉上，而且参与调控停滞复制叉上新合成DNA链的稳定性和停滞复制叉的重新起始。为了进一步研究BCAS2如何调控DRSR，一方面验证BCAS2对RPA的影响，发现BCAS2缺失影响了RPA的磷酸化以及复制叉上RPA的募集，这与之前的报道相一致;另一方面通过串联亲和层析(tandem affinity purification)结合蛋白质谱的方法，筛选可能与BCAS2相互结合的蛋白。结果显示，除了PRP19、CDC5L、RLRG1等许多已知与BCAS2相结合的蛋白外，也筛选出大量的核糖体蛋白和RNA结合蛋白（RNA binding protein）。对筛选出的240个蛋白进行GO功能聚类分析(GO terms enrichment analysis)，结果表明这些蛋白大多与RNA剪接相关。因此，BCAS2除了通过招募RPA直接参与调控DRSR外，也有可能通过影响DNA复制压力反应中相关功能基因的剪接，进而间接地参与DRSR。为了验证这个猜想，采用蛋白截短实验进一步展开研究。BCAS2蛋白含有225个氨基酸，一方面BCAS2通过N端60个氨基酸与RPA相互结合，从而调控RPA的磷酸化和募集;另一方面BCAS2也通过C端两个保守结构域CC1和CC2与CDC5L和PLRG1相互结合形成Prp19复合体，进而参与RNA的剪接。蛋白截短的实验表明，BCAS2N端60个氨基酸对停滞复制叉重新起始具有非常重要的调控作用，而C端高度保守的CC1和CC2结构域参与调控停滞复制叉上新合成DNA链的稳定性。为了进一步解析RNA剪接对DRSR的调控，对正常和Bcas2诱导敲除的细胞进行RNA深度测序分析。分析结果表明，BCAS2缺失的细胞转录组水平基因的表达基本正常，但是诸多基因的可变剪接发生了显著的变化。在BCAS2缺失的细胞中，共有768个基因的可变剪接发生了变化，产生908个差异显著的可变剪接事件(P＜0.05)。对上述768个基因进行功能聚类分析，结果表明，这些产生差异可变剪接的基因参与蛋白磷酸化、细胞内信号转导、染色质共价修饰、蛋白泛素化与去泛素化、细胞增殖和细胞分化等生物学过程。有意思的是，BCAS2还可能参与调控DNA修复(DNA repair)和DNA复制压力反应(replication fork processing)过程中43个基因的可变剪接。从中挑选了排名相对靠前并且功能研究较为清楚的8个基因(Brca2、Rad18、Sun2、Ssbp3、Exog、Lmtk3、Map2k4和Cdkl2)，通过RT-PCR和real-time PCR，成功验证出Brca2、Sun2、Ssbp3和Exog的可变剪接发生异常。此外，BCAS2的缺失也引起了Brca2转录水平的下调。 综上所述，本研究证明了BCAS2参与调控DNA复制压力反应，并且阐明BCAS2可能通过两个途径参与调控DRSR:一方面通过RPA参与调控停滞复制叉的重新起始;另一方面也可能通过RNA剪接参与调控新合成DNA链的稳定。本课题不仅为DNA复制压力反应的研究提供了新的思路，而且为可变剪接的生理功能研究提供了重要的理论基础。