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第一部分体外分析DOCK5对肝细胞脂代谢的影响目的:体外改变DOCK5表达证实其对肝细胞脂代谢的影响。方法:构建DOCK5过表达质粒和抑制腺病毒,感染Hepa1-6细胞,使用FFAs诱导肝细胞脂肪变性造高脂模型。提取RNA和蛋白,PCR法测定肝脏脂质代谢相关基因CD36、FATP2、FATP4、FATP5、FABP4、ACC、chREBP、FAS、SCD-1、SREBP1、Acox1、CPT-1、MCAD、PPARα、ApoB、MTTP、LXRα、PPARγ、PXR、RXRs等mRNA的变化,Western blot法测定肝脏脂质代谢相关基因SREBP1、FAS、CD36、PPARα、LXRα、PPARγ等蛋白的变化。结果:构建DOCK5过表达质粒和抑制腺病毒并成功感染Hepa1-6细胞。与对照组相比较,DOCK5过表达时,脂肪酸摄取相关基因CD36、脂肪酸合成相关基因FAS、SREBP1显著下降,而脂肪酸摄取相关基因FATPs、FABP4,脂肪酸合成相关基因ACC、chREBP、SCD-1,脂肪酸β氧化相关基因Acox1、CPT-1、MCAD、PPARα,VLDL分泌相关基因ApoB、MTTP等无明显变化。其次,DOCK5过表达组核受体基因LXRα、PPARγ表达明显下降。然而,DOCK5表达受抑制时,脂肪酸摄取相关基因CD36、脂肪酸合成相关基因FAS显著升高,和CD36相关的肝核受体家族成员LXRα、PPARγ表达明显升高,其他脂质代谢相关的基因无明显变化。结论:DOCK5参与调控肝脏脂质代谢,这一过程可能与LXRα、PPARγ、FAS和CD36的表达密切相关。第二部分DOCK5基因敲除引起高脂诱导的肝细胞脂肪变性目的:通过对比研究DOCK5敲除鼠和野生鼠,进一步探讨DOCK5调控肝脏脂质代谢的潜在机制。方法:首先分离培养DOCK5敲除鼠和C57野生鼠原代肝细胞,并用FFAs和BSA进行模型,油红O染色观察肝细胞内脂滴的含量,试剂盒测定肝脏甘油三酯等含量。提取原代肝细胞RNA和蛋白,PCR法检测肝脏脂质代谢相关基因(脂肪酸摄取、合成、氧化和VLDL分泌相关指标)的m RNA变化,Western blot法测定肝脏脂代谢相关基因CD36、FAS、SREBP1等蛋白的变化。其次,分离C57野生鼠原代肝细胞培养,转染DOCK5过表达质粒,检测上述脂代谢相关指标的表达情况。结果:DOCK5敲除鼠的FFAs组肝细胞内脂滴及TG的含量显著高于C57野生鼠对照组;DOCK5-/--FFAs组脂肪酸摄取相关基因CD36、脂肪酸合成相关基因FAS、SREBP1的m RNA和蛋白较野生鼠显著升高(P<0.05),而其他脂代谢相关基因FATP2、FATP4、FATP5、FABP4、、ACC、ch REBP、SCD1、、Acox1、CPT-1、MCAD、PPARα、Apo B、MTTP等m RNA水平均无明显变化。DOCK5-/--FFAs组的肝核受体相关基因LXRα和PPARγ的m RNA和蛋白表达上调(P<0.05),而配体RXRs无显著变化。C57的原代肝细胞经转染DOCK5过表达质粒之后,细胞内脂滴和TG含量减少,脂肪酸摄取相关基因CD36、脂肪酸合成相关基因FAS及肝核受体相关基因LXRα和PPARγ的m RNA和蛋白表达下降。结论:DOCK5基因敲除鼠能引起高脂诱导的肝细胞脂肪变性,可能与脂肪酸摄取相关基因CD36和肝核受体LXRα、PPARγ的表达变化密切相关。第三部分DOCK5调控肝脏甘油三酯代谢的机制研究目的:探索DOCK5调控肝脏甘油三酯代谢的机制研究。方法:首先分离培养CD36-/-原代肝细胞,转染DOCK5过表达质粒/抑制腺病毒,FFAs造肝细胞脂肪变性模型。油红O染色观察肝细胞脂滴多少,试剂盒测定甘油三酯含量,验证DOCK5是否通过CD36来调控肝细胞脂质代谢。其次,免疫荧光法检测DOCK5在肝细胞的定位,验证DOCK5是在细胞核或质内进行参与调控肝脏脂质代谢。最后,构建CD36基因启动子截短质粒,利用双荧光素酶报告基因分析DOCK5基因对CD36基因启动子的调控作用。结果:在CD36-/-原代肝细胞中,DOCK5表达上下调均不能影响细胞内脂滴和TG含量。细胞免疫荧光结果发现:DOCK5表达于肝模型Hepa1-6细胞的细胞质、细胞核中且主要位于细胞质,是一种胞质蛋白。我们成功构建CD36启动子截短质粒,双荧光素酶报告基因分析显示,与空载质粒相比,加入DOCK5过表达质粒后,CD36基因启动子的活性明显降低(P<0.05),且DOCK5对CD36基因启动子的作用区域可能位于-1138~-483bp之间,作用位点为LXRE结合元件。结论:DOCK5通过作用于CD36基因启动子的LXR元件调控CD36的表达,从而影响肝细胞脂质代谢。