论文部分内容阅读
本课题首次检测了豚鼠后极部眼球壁组织和人巩膜成纤维细胞M4受体表达，并将新型选择性M4受体拮抗剂PD102807用于近视模型，研究和探讨了M4受体在近视发生发展中的作用。
第一部分M4受体及其拮抗剂PD102807在豚鼠实验性近视中的作用研究
第一章豚鼠近视模型建立及比较目的建立及比较豚鼠形觉剥夺性近视(FDM)和离焦性近视(LIM)模型
方法4周龄三色豚鼠28只，随机分成3组：Ⅰ正常对照组；Ⅱ形觉剥夺性近视组；Ⅲ离焦性近视组。均以右眼为实验眼。Ⅱ组以半透明眼罩遮盖右眼，Ⅲ组配戴-4D凹透镜片。两周后测量3组动物右眼屈光度、眼轴长度。并分别用光学显微镜和透射电镜观察后极部眼球壁组织形态。
结果1、模型建立两周后，形觉剥夺组较对照眼和正常对照组眼屈光度、眼轴长度的差异有统计学意义；离焦组较对照眼和正常对照组屈光度变化有统计学意义，而眼轴长度实验前后的变化无统计学意义(P＞0.05)。形觉剥夺组与离焦性近视组屈光度、眼轴长度相比没有统计学差异(P＞0.05)。
2、光镜下：剥夺眼和离焦性近视眼后极部巩膜较对照组明显变薄，成纤维细胞密度降低，细胞外基质相对增多。剥夺眼和离焦性近视眼后极部巩膜未见明显差异。
3、电镜下：剥夺眼和离焦性近视眼与正常对照组和对照眼比较，后极部胶原纤维直径分布明显不同，其胶原纤维平均直径显著减小。且剥夺眼和离焦性近视眼胶原纤维间区域增大，后极部的纤维密度减小。剥夺眼和离焦性近视眼胶原纤维直径及纤维密度差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论配戴半透明眼罩和凹透镜片可在短期内诱导豚鼠实验性近视，成功的建立形觉剥夺性近视和离焦性近视眼实验动物模型。两种模型得到的后极部巩膜光镜和电镜下的形态相似，和正常巩膜有显著差异。
第二章豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜组织M4受体表达目的检测M4受体在豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜组织的表达及分布
方法4周龄三色豚鼠21只，其中7只动物眼球制备石蜡切片，免疫组织化学染色法检测后极部球壁组织M4受体表达与分布；其余动物分别提取眼视网膜、脉络膜和巩膜组织RNA和蛋白质，RT-PCR、Westernblot检测M4受体mRNA和蛋白质表达。
结果1、豚鼠视网膜、脉络膜和巩膜组织均表达M4受体mRNA，扩增产物约为221bp，阴性对照未见扩增产物。
2、Westernblot显示：豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜组织均表达明显的M4受体免疫反应活性，分子量约为38kd。阴性对照组无阳性表达条带。
3、免疫组织化学染色显示：M4受体分布于豚鼠视网膜RPE细胞层，光感受器细胞层、外核层、内核层，大多数神经节细胞，以及内从状层和内核层交界区；大多数脉络膜血管壁以及巩膜基质中也可见M4受体阳性表达。
结论豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜组织均有M4受体蛋白表达。
第三章PD102807抑制豚鼠离焦性近视疗效及机制研究
目的观察PD102807对豚鼠离焦性近视的疗效，检测PD102807对离焦性近视豚鼠眼巩膜组织M4受体、decorin核心蛋白以及MMP-2/TIMP-2在mRNA和蛋白质表达水平的影响，探讨PD102807抑制近视的巩膜机制。
方法4周龄三色豚鼠32只，随机分为：Ⅰ正常对照组；Ⅱ单纯离焦组；Ⅲ0.1N盐酸对照组；ⅣPD102807治疗组(2％PD102807溶解于0.1N盐酸溶液)。均以右眼为实验眼。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组豚鼠的右眼配戴-4D凹透镜片。药物对照组和PD102807组的实验眼分别隔日玻璃体腔内注射0.1N盐酸溶液和2％PD102807溶液。两周后检测4组动物右眼屈光度、眼轴长度。荧光定量PCR、RT-PCR、Westernblot检测M4受体、decorin核心蛋白以及MMP-2/TIMP-2在mRNA和蛋白质水平表达。
结果1、治疗两周后，PD102807治疗组和离焦组及盐酸组相比，眼屈光度分别增加2.06D±1.36D、1.00D±0.96D(P＜0.01)。眼轴长度分别缩短了0.13mm±0.17mm、0.14mm±0.19mm，统计学分析无显著性差异(P＞0.05)。PD102807治疗组与正常组相比，屈光度减少1.44D±1.70D，(P＜0.05)；眼轴长度增加0.04mm±0.10mm，统计学分析无显著性差异(P＞0.05)。离焦组与正常组相比，各项指标差异显著(P＜0.05)，与盐酸组比较各项指标无显著性差异(P＞0.05)。
2、探针法荧光定量PCR显示：PD102807组巩膜组织M4受体mRNA表达量分别为离焦组和盐酸组豚鼠眼的7.35倍和5.06倍；较正常组减少了25.45％；离焦组与正常组相比，M4受体mRNA表达量降低89.85％，与药物对照组无显著差异。Westernblot显示：PD102807组M4受体蛋白表达较离焦组和盐酸组升高，而较正常组降低；离焦组M4受体蛋白表达量较正常组明显降低，与盐酸组无显著差异。
3、染料法(SYBRGreenⅠ)荧光定量PCR显示：PD102807组巩膜组织decorinmRNA表达量分别为离焦组和盐酸组豚鼠眼1.53倍和1.37倍，较正常组减少8.01％；离焦组与正常组相比，decorinmRNA表达量降低39.95％，与药物对照组无显著差异。Westernblot显示：PD102807治疗组decorin核心蛋白表达较离焦组和盐酸组升高，较正常组降低。离焦组decorin核心蛋白表达量较正常组明显降低。
4、RT-PCR显示：PD102807治疗组与离焦组和药物对照组相比，MMP-2的表达水平显著降低，TIMP-2水平明显升高；与正常组相比，MMP-2的表达水平升高，TIMP-2水平降低。离焦组与正常组相比，MMP-2mRNA的表达显著升高，TIMP-2mRNA表达水平明显降低，与盐酸组无显著性差异。Westernblot印迹显示：PD102807组和离焦组及盐酸组相比，MMP-2蛋白表达水平显著下降，TIMP-2显著升高；和正常组相比，MMP-2表达水平升高，TIMP-2水平下降；离焦组与正常组相比，MMP-2的表达水平显著升高，TIMP-2的水平明显下降，与盐酸组无显著差异。
结论1、豚鼠离焦性近视形成过程中，M4受体数目下调，后极部巩膜组织decorin合成积累降低，MMP-2/TIMP-2表达增高。巩膜组织M4受体可能参与豚鼠离焦性近视的形成；
2、玻璃体腔注射M4受体拮抗剂PD102807能部分抑制豚鼠离焦性近视的发生发展，其作用机制可能为从转录水平增加M4受体表达，降低MMP-2/TIMP-2水平，促使decorin合成积累增加，从而延缓近视的进展。
第二部分人巩膜成纤维细胞M4受体表达及PD102807对其增殖抑制的研究
第一章PD102807对人巩膜成纤维细胞增殖抑制作用观察目的构建体外实验模型，观察PD102807对人巩膜成纤维细胞的增值抑制作用。
方法原代培养并鉴定人巩膜成纤维细胞；MTT法检测PD102807对人巩膜成纤维细胞增殖影响的剂量效应和时间效应；流式细胞法检测PD102807对人巩膜成纤维细胞的细胞周期效应。
结果PD102807抑制HSF增殖，并呈剂量依赖性。半数抑制浓度(IC50)为20μM。当药物浓度≥50μM时，出现明显的细胞调亡；20μMPD102807在48小时显著抑制巩膜成纤维细胞增殖(P＜0.05)，并呈时间依赖性。PD102807可显著增加巩膜成纤维细胞的G1/0期细胞，减少S期细胞，降低细胞增殖指数，与对照组的差异有显著性(P＜0.05)，并呈量效关系。
结论PD102807显著抑制人巩膜成纤维细胞增殖，且在一定药物终浓度范围内呈剂量和时间依赖性，可能通过增加巩膜成纤维细胞的G1/0期细胞，减少S期细胞来达到增殖抑制作用。
第二章PD102807对人巩膜成纤维细胞M4受体表达的影响目的观察人巩膜成纤维细胞M4受体表达，检测PD102807对人巩膜成纤维细胞对M4受体表达的影响。
方法培养细胞分别加入0、20、30μMPD102807。72h后，分别提取各组细胞RNA和蛋白，荧光定量PCR、免疫细胞化学、Westernblot分别检测M4受体mRNA和蛋白质水平表达。
结果1、正常人巩膜成纤维细胞表达M4受体mRNA，与正常人巩膜成纤维细胞表达M4受体mRNA表达量相比，M4受体mRNA表达量在20μMPD102807组降低39.18％，30μMPD102807增加256.73％。
2、ICC结果显示：人巩膜成纤维细胞在胞膜和胞质均表达M4受体蛋白。药物干预结果显示20μM组M4受体蛋白表达呈阳性(++)，两者在人巩膜成纤维细胞中的表达水平无显著性差异；30μM组染色呈强阳性(+++)，与0μM组相比染色明显增强，差异显著。
3、Westernblot结果显示：正常人巩膜成纤维细胞表达M4受体蛋白。20μM组较正常组M4受体蛋白表达量降低14.08％；而30μM组较正常组M4受体蛋白表达量升高34.35％。
结论人巩膜成纤维细胞存在M4受体表达。PD102807增加人巩膜成纤维细胞M4受体在mRNA和蛋白水平表达。M4受体可能参与实验性近视形成机制，M4受体拮抗剂PD102807可能通过增加巩膜M4受体表达来延缓近视进展。