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目的研究天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)对小鼠B细胞淋巴瘤A20同种移植模型肿瘤生长的抑制作用,并从细胞毒作用、免疫调节作用和抗肿瘤血管新生等方面进一步探讨其可能的作用机制。为进一步探索TCS抗淋巴瘤的作用机制和临床应用提供全面准确的实验依据。方法首先构建鼠源性B细胞淋巴瘤A20细胞株BALB/C小鼠荷瘤模型,随机分为4组,10只／组,分别给予不同剂量的TCS(0.2,0.4和0.8mg/kg/d)或NS (0.2mL/d)腹腔注射,持续7d。测量肿瘤体积、小鼠体重,观察生存时间。然后从细胞毒性、免疫调节、抗肿瘤血管新生三个方面对TCS抗小鼠B细胞淋巴瘤的作用机制进行探讨。不同浓度的TCS(2.5,5,10,20,40μg/mL)作用于A20细胞24-72h,分别采用CCK-8、流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测细胞增殖抑制率、凋亡率和细胞周期,观察TCS对A20细胞的细胞毒作用。在上述体内实验的基础上,通过ELISA检测荷瘤小鼠TNF-α, IFN-γ和IL-2的血清水平,FCM检测荷瘤小鼠脾脏中T、B淋巴细胞和NK细胞的比例,评估TCS对A20荷瘤小鼠免疫功能的影响。在TCS抗肿瘤血管新生实验中,首先通过HE染色和CD31血管免疫荧光计算微血管密度(microvessel density, MVD),然后通过ELISA检测荷瘤小鼠MMP-2和MMP-9的血清水平,通过免疫组化测定肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达。为了明确TCS抗血管新生的作用途径,进一步运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PC R)和蛋白免疫印迹(Western Blot)技术检测不同浓度TCS对A20细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白和基因表达水平的影响。另外,将上述相应浓度的TCS作用于脐静脉内皮细胞(HUVECs) 24-72h,分别采用CCK-8、FCM检测细胞增殖抑制率、凋亡率和细胞周期,观察TCS对HUVECs生物学活性的影响。进一步通过划痕实验、Transwell侵袭实验观察不同浓度的TCS(0,1.5,3,6μg/mL)对HUVECs迁移能力和侵袭能力的影响。最后,利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验验证TCS体内抗血管新生的作用。结果1.TCS抑制A20荷瘤小鼠移植瘤的生长TCS高、中剂量组小鼠的移植瘤体积分别为367±316mm3、516±39.3mm3,较对照组(1215±98.91mm3)和低剂量组(1005±81.56mm3)显著减低(P＜0.05); TCS高、中剂量组的瘤重分别为0.36610.08g、0.968±0.26g,明显低于对照组(2.43±0.62g)和低剂量组(1.55±0.17g)(P<0.05)；高、中、低三个治疗组的抑瘤率分别为60.1%、46.2%和21.2%。高、中剂量TCS组荷瘤小鼠的中位生存时间分别为42±5d、34±3d,与低剂量组(25±2d)和对照组(24±2d)相比明显延长(P<0.05或P<0.01)。2.TCS对A20细胞无直接细胞毒作用,对荷瘤小鼠的免疫功能无明显影响体外实验研究表明,TCS在对A20细胞的增殖活性没有明显抑制作用(P>0.05),对A20细胞的凋亡和细胞周期无显著影响(P>0.05)。体内实验研究结果显示,TCS对荷瘤小鼠TNF-α、IL-2和IFN-γ的血清水平无明显影响(P>0.05),对荷瘤小鼠脾脏中T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞和NK细胞的比例均无显著影响(P>0.05)。3.TCS能够抑制淋巴瘤血管新生HE染色后对照组和低、中、高剂量TCS组小鼠淋巴瘤组织的MVD分别为31±7、24±5、12±4和9±3Vessels/HPF;免疫荧光检测四个组的MVD分别为38±4、32±3、13±3和10±2Vessels/HPF。方差分析表明,TCS中、高剂量组的MVD明显低于对照组和低剂量组(P<0.05或P<0.01)。免疫组化结果表明,中、高剂量TCS能够降低小鼠肿瘤组织中VEGF的表达(P<0.05)。对照组荷瘤小鼠血清中MMP-2和MMP-9的含量分别为83.56±16.35ng/mL和27.76±7.8ng/mL,低剂量组小鼠血清MMP-2水平为67.58±11.04ng/mL, MMP-9为 21.84±7.23ng/mL;与上述两组相比,高剂量组(MMP-2:27.22±4.38ng/mL, MMP-9: 7.58±2.08ng/mL)和中剂量组(MMP-2:41.28±7.04ng/mL, MMP-9:14.02±3.39ng/mL)荷瘤小鼠的MMP-2和MMP-9水平明显降低(P<0.05)。4.TCS抑制HUVECs的生物学活性及运动能力TCS可抑制HUVECs的增殖活性,并存在浓度和时间依赖性,24,48和72h的IC50分别为27.39±0.8,14.04±0.03和5.9±0.2μg/mL; 5,10和15μg／mL浓度的TCS作用48后,HUVECs的早期／晚期凋亡率分别达到(17.1±2.6)%,(32.6±3.6)%和(52.1±5.3)%,G0／G1期细胞的比例分别是(73.5±4.89)%,(74.2±4.2)%和(76.8±4.32)%,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与对照组相比,TCS在1.5,3和6μg／mL的浓度下作用24h,HUVECs划痕的直径分别增加(26.5±5.9)%,(35.7±5.1)%和(66.2±7.3)%,作用48h划痕的直径分别增加(21.5±9.5)%,(68.1±7.3)%和(173.5±20.5)%。TCS在上述浓度范围内作用24h,HUVECs的侵袭能力分别下降至(63.65±2.53)%,(56.18±2.62)%和(42.43±3.04)%,与对照组的差异均具统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论TCS能够抑制小鼠B细胞淋巴瘤A20在同种移植模型体内的生长,能够延长荷瘤小鼠的生存时间。在TCS抗小鼠B细胞淋巴瘤的作用机制探讨过程中发现,TCS对体外培养的A20淋巴瘤细胞没有直接的细胞毒作用,对A20荷瘤小鼠的免疫功能也没有明显的影响,其主要的作用机制在于抑制淋巴瘤的血管新生。进一步的研究表明,TCS抗淋巴瘤血管新生的途径主要包括：1.抑制小鼠淋巴瘤细胞A20细胞株VEGF、bFGF蛋白的表达和VEGFmRNA、bFGF mRNA的转录；2.降低细胞外基质环境中MMP-2和MMP-9的水平；3.抑制HUVECs的增殖,阻滞细胞周期,诱导其凋亡,并抑制其迁移和侵袭等运动能力。研究意义本研究首先通过体内实验证明了天花粉蛋白的抗淋巴瘤价值,然后从对淋巴瘤细胞的细胞毒性、荷瘤小鼠的免疫调节作用和抗肿瘤血管新生等作用机制的角度进行了探索。从细胞和分子水平观察了天花粉蛋白对肿瘤细胞分泌促血管生成因子、细胞外基质金属蛋白酶和血管内皮细胞的影响,初步明确了其抗淋巴瘤血管新生的途径,从客观的角度为天花粉蛋白治疗淋巴瘤提供了有力的实验依据和理论基础。