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研究背景在缺血缺氧性神经系统疾病,如缺血性脑卒中、脊髓损伤中,缺氧是关键的病理性刺激因素,受损的神经组织和细胞因缺乏氧供,能量合成不足,代谢功能受限,导致细胞损伤乃至细胞死亡,从而导致机体的功能障碍。坏死和凋亡是神经系统缺氧损伤的两个主要病理途径,在缺血中心区,血流量极度减少,细胞坏死；在缺血周边区,侧支血流可以缓冲损伤的程度,细胞多表现为凋亡形式。受缺血区域周围细胞的凋亡包括Caspase依赖途径和Caspase非依赖途径,Caspase-3是细胞凋亡的效应物之一,能使维持生命的蛋白形成众多裂口,从而导致细胞死亡。细胞坏死不可逆转,但细胞凋亡是受细胞基因调控的、具有程序化发生特点的细胞渐进性死亡过程。众多因子参与到细胞凋亡的启动与发展过程,通过对细胞因子及其相关通路的调控,可以抑制细胞凋亡,减轻细胞损伤程度。为减轻损伤,机体会产生,一些与缺氧相关的代谢酶和转录因子会参与机体的缺氧调节。缺氧诱导因子HIF-1和基因同源(RHO)家族就参与众多缺氧性疾病的调节过程。缺氧诱导因子HIF-1是细胞缺氧状态下参与应激反应的重要因子,只有在缺氧状态下,HIF-1才发挥其缺氧适应作用。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β组成。HIF-1α含有氧依赖降解结构域,是低氧功能单位,而HIF-1β只参与结构性构成。已有研究发现,在缺氧性疾病,如严重烧伤、慢性阻塞性肺病、癌症等疾病的病理生理变化中,HIF-1能激活多种靶基因的转录,并和其他信号通路互相影响,在缺氧后促进血管生成、重建细胞代谢等途径发挥作用。亦有研究证实,在缺血缺氧性神经细胞损伤后,HIF-1可调控细胞凋亡,抑制或诱导细胞凋亡。RhoA属于Rho小GTP酶家族,是RHO家族之一。缺氧激活之后,RhoA触发信号级联,可直接产生各种细胞反应。已证实RhoA途径可起到促进神经轴突的再生、减轻血管痉挛、促进细胞骨架的重组生长、减少活性氧自由基的产生、减轻细胞凋亡等作用。Rho激酶(ROCK)是RhoA的下游靶效应分子,其包括ROCK1和ROCK2两种成分。有研究证明在神经轴突再生过程中,RhoA/Rho激酶通路参与HIF-1α的表达与代谢过程。本课题旨在探讨神经细胞缺氧损伤早期,HIF-1α及RhoA在神经细胞凋亡中所起作用,并研究HIF-1α信号通路是否与RhoA通路存在相关及其具体作用方式。PC12细胞为可移植的鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞,体外培养可具备神经元细胞特性。故实验选取PC12细胞体外培养并建立缺氧模型,在不同时间点观察细胞凋亡及HIF-1α/RhoA对细胞凋亡的作用及两者之间表达的相关性。目的1.观察缺氧48小时内PC12细胞凋亡状况；2.研究PC12细胞缺氧早期HIF-1α的表达及其对细胞凋亡的影响；3.研究缺氧早期PC12细胞中RhoA的表达及其对细胞凋亡的影响。4.研究缺氧早期PC12细胞中HIF-1α的表达是否与RhoA通路相关。研究方法1.制作PC12细胞缺氧模型购买PC12嗜铬细胞瘤细胞株置于低氧培养箱中,在37℃条件下培养0,2,4,6,12,24和48小时。使细胞持续处于低氧状态培养,并在相应时间点进行实验干预。2.分别于不同时间点检测缺氧后PC12细胞凋亡状况2.1 PC12细胞凋亡检测：使用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)凋亡检测试剂盒,并使用FACScan流式细胞仪来分析细胞凋亡的水平。结果表示为凋亡细胞占细胞总数的百分比。2.2 caspase3活性测定使用caspase3活性测定试剂盒测定caspase3活性,用7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的相对荧光强度来表达活性,并与对照组相比。2.3 procaspase-3 (caspase-3前体)测定：Western blot分析测定PC12细胞缺氧处理后12小时、24小时、48小时procaspase-3相对于β-肌动蛋白的含。2.4活化的caspase测定：Western blot分析测定。2.5 PARP(聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶)裂解物测定：Western blot分析测定。2.6释放细胞色素C (Cyto C)测定：Western blot分析测定。3.过表达HIF-1α基因的质粒,检测HIF-1α在缺氧诱导的PC12细胞凋亡中的作用。3.1建立HIF-1α过表达转染组模型和对照组模型：pcDNA3.1 (+)为载体过表达HIF-1α基因,同时建立对照组,两组转染成功后,同第1条所述方法,建立低氧模型。3.2测定HIF-1α转染状况：RT-PCR的和Western blot分析转染组和对照组在缺氧12小时、24小时、48小时HIF-1α和HIF-1β的mRNA和蛋白水平。3.3 测定HIF-1α转染组和对照组细胞凋亡数,测定HIF-1α转染组和对照组caspase-3活性。4. 检测PC12细胞缺氧处理后RhoA及其相关蛋白(RhoB, Rock 1和Rock 2)的表达。Western blot分析测定PC12细胞缺氧处理后2小时、4小时、6小时,RhoA、RhoB、Rock 1、Rock2含量。5. 小干扰RNA (si RNA)印制RhoA表达,检测缺氧诱导下PC12细胞中HIF-1α表达,观察其与是否存在RhoA依赖关系及其对细胞凋亡的影响。5.1建立isRNA RhoA组模型和对照组模型：购买isRNA RhoA试剂,转染PC12细胞,同时建立对照组,RT-PCR和Western blot分析RhoA的mRNA和蛋白水平。两组转染成功后,同第1条所述方法,建立低氧模型。5.2 HIF-1α测定：RT-PCR和Western blot分析测定isRNA RhoA组和对照组在缺氧12小时、24小时、48小时HIF-1α的mRNA和蛋白水平。5.3细胞凋亡的测定：细胞凋亡数、caspase-3活性测定,两组统计学分析。6.数据处理及统计所得数据均用Means ± SEM表示,使用SPSS16.0统计学软件进行统计学分析,组间比较采用ANOVA,组间两两比较采用Dunnet检验,P<0.05时即认为差别有显著性。结果1.PCI2细胞缺氧处理后48h,细胞凋亡数目增力口,caspase-3活性增强,其前体含量减少,活化产物含量增加,PARP裂解物增多,释放的Cyto C增多。2. HIF-1α过表达后,PCI2细胞缺氧处理12h、24h、48h, HIF-1α的表达增加,HIF-1β表达未见明显变化,转染组细胞凋亡数目减少,caspase-3活性降低。3.PCI2细胞缺氧处理后2h、4h、6h, RhoA, Rock1、Rock2的含量增加,RhoB的含量未见明显改变。4.抑制RhoA表达后,PCI2细胞缺氧处理12h、24h、48h, HIF-1α表达减少,细胞凋亡数目增加,caspase-3活性增强。结论1.PCI2细胞缺氧48h,细胞凋亡随时间的增加而增加。2.PCI2细胞缺氧后24-48h, HIF-1α并具有保护细胞、减轻凋亡的作用。3.PCI2细胞缺氧后2-6h, RhoA通路具有抑制凋亡的作用。4.PCI2细胞缺氧后2-6h, RhoB的信号通路未参与缺氧后细胞调控。5.PCI2细胞缺氧后48h, HIF-1α的表达呈RhoA的依赖性。