论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的猪的一种高度传染病，又称“猪蓝耳病”，本病以妊娠母猪的繁殖障碍(后期流产、死胎、木乃伊胎、弱胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病(间质性肺炎)为特征。本病给世界养猪业造成巨大的经济损失，现已成为危害规模化养猪生产的主要疫病之一。目前，已有商品化的弱毒疫苗和灭活苗用于PRRS的防制，但由于其自身的缺陷而不能提供有效的免疫保护。PRRSV属于尼多病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员，为有囊膜、单股正链RNA病毒，其致病机理和免疫特性尚不十分清楚。本研究设计构建了表达PRRSV膜相关蛋白GP3、GP4、GP5和M蛋白的重组腺病毒，通过小鼠免疫试验筛选了PRRSV重组腺病毒免疫候选分子，为PRRSV基因工程疫苗研究奠定了基础。本研究内容分为以下6个部分：1．PRRSV CTL细胞免疫检测方法的建立为了探讨PRRSV GP3、GP4、GP5、M蛋白基因诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答的能力，建立一种非放射性、简便易行的检测特异性CTL的方法，应用RT-PCR方法扩增得到GP3、GP4、GP5和M蛋白基因并克隆入真核表达载体pcDNA3，构建重组表达质粒pcDNAB-GP3、pcDNA3-GP4、pcDNA3-GP5和pcDNAB-M。将重组质粒转染至NIH3T3细胞，G418筛选克隆，经间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白表达，成功培育了4株能分别表达PRRSV GP3、GP4、GP5、M蛋白的细胞株NIH3T3／GP3、NIH3T3／GP4、NIH3T3／GP5和NIH3T3／M，可作为PRRSV CTL检测方法中的靶细胞。以NIH3T3细胞为靶细胞确定了最适靶细胞数(2×10~5／mL)，建立了检测PRRSV特异性细胞毒T淋巴细胞的杀伤效应的乳酸脱氢酶释放法。2．PRRSV M与GP5蛋白融合表达及其免疫特性研究为了提高GP5蛋白的免疫原性，在构建了表达GP5蛋白重组腺病毒的基础上，我们将PRRSV的M蛋白与GP5融合表达，间接免疫荧光试验和Western blot证明，成功构建了融合表达M与GP5蛋白的重组腺病毒(rAd-M-GP5)。取120只BALB／c小鼠，随机分成5组，每组24只，将重组腺病毒rAd-GP5(表达GP5蛋白)、rAd-M(表达M蛋白)和rAd-M-GP5(表达M-GP5融合蛋白)免疫小鼠，间隔两周加强免疫一次。对照组分别注射wtAd(野生型腺病毒)或PBS，观察56天，间隔2周检测PRRSV中和抗体，比较其细胞免疫水平，结果为：加强免疫后2周rAd-M-GP5免疫组中和抗体滴度明显高于rAd-GP5免疫组，抗体效价达到1：102(56dpi)。同时，免疫rAd-M-GP5的小鼠产生了比rAd-M(28％)更高水平的PRRSV特异的CTL反应，达到36.2％(42dpi)，而rAd-GP5产生的PRRSV特异的应答较低。该结果说明，M与GP5融合后能显著增强GP5蛋白诱导的体液免疫应答和细胞免疫应答。3．GP3蛋白的信号肽序列和N-端疏水域对GP3免疫特性的影响次要结构蛋白GP3与免疫保护有关，但是其免疫特性知之甚少。为了研究信号肽序列和N-端疏水域对GP3免疫特性的影响，我们构建了表达缺失该区域(aa2～64)的GP3蛋白的重组腺病毒(rAd-tGP3)，并将其免疫特性与GP3进行比较。结果发现，小鼠在加强免疫重组腺病毒rAd-tGP3和rAd-GP3后2周产生了PRRSV特异的细胞免疫应答，包括T细胞增殖和细胞毒T细胞应答。而且，免疫rAd-tGP3的小鼠的应答水平(中和抗体1：14、SI为4.5、杀伤率为36％(56dpi))明显高于rAd-GP3免疫组(中和抗体1：10、SI为3.3、杀伤率为28％(56dpi))(P＜0.05)。表明GP3蛋白的前64个氨基酸对GP3蛋白的构象和抗原结构可能有重要影响。4．GP3和GP4蛋白对GP5蛋白的协同免疫特性研究为了研究GP3或GP4蛋白能否协同GP5蛋白的免疫原性，我们分别将GP3、GP4、GP3和GP4与GP5蛋白融合表达，间接免疫荧光试验和Western blot证明，成功构建了融合表达GP3-GP5(rAd-GP3-GP5)、GP4-GP5(rAd-GP4-GP5)以及GP3-GP4-GP5(rAd-GP3-GP4-GP5)的重组腺病毒。同时还构建了2株重组腺病毒，分别表达单个的GP3和GP4蛋白。将重组腺病毒免疫BALB／c小鼠，间隔两周加强免疫一次。对照组分别注射wtAd或PBS。结果发现，小鼠在加强免疫后2周产生了PRRSV特异的体液和细胞免疫应答。然而，只有免疫rAd-GP3-GP5、rAd-GP4-GP5、rAd-GP3-GP4-GP5的小鼠产生了高滴度的中和抗体，效价分别达到1：82、1：96、1：120(56dpi)，并诱导较强的淋巴细胞增殖。同时，相对于rAd-GP3(21.4％)和rAd-GP5(18％)免疫组，免疫rAd-GP3-GP5和rAd-GP3-GPd-GP5的小鼠产生了更高水平的PRRSV特异的CTL反应，杀伤效率分别为37.5％和44.7％(42dpi)。说明GP3蛋白或GP3与GP4蛋白对GP5蛋白的体液免疫和细胞免疫有协同促进作用。5．GP5蛋白信号肽和非中和表位对其诱导中和抗体应答的影响为了研究GP5蛋白的信号肽和非中和表位对其诱导中和抗体的影响，我们构建了表达缺失非中和表位(A)和／或信号肽序列的GP5蛋白的3个重组腺病毒，利用BALB／c小鼠评估它们诱导体液免疫应答的特性。即：表达缺失非中和表位(aa27-31)的GP5(rAd-GP5△27／31)、表达缺失A表位及A表位与中和表位(B)中间的序列(aa27-36)的GP5(rAd-GP5△27／36)、以及表达缺失B表位之前的序列(包括信号肽，aa2-36)的突变体(rAd-GP5△2／36)。结果为：3株重组体接种小鼠后均产生了明显的抗PRRSV抗体的应答和明显的中和抗体，其滴度达到1：30、1：19、1：14(56dpi)，明显高于表达野生型GP5的重组腺病毒rAd-GP5诱导的中和抗体(1：8)。表明去除GP5蛋白A表位能提高其诱导产生中和抗体，而且，信号肽序列及A表位周围的序列能影响中和抗体的产生水平。6．GP5蛋白N-糖基对其诱导中和抗体应答的影响对于一些病毒来说，如HIV、sIV和HBV，“糖基屏蔽效应”可能是病毒逃避中和免疫应答的一个主要机理，使得病毒在体内持续感染。PRRSV GP5蛋白含有4个糖基化位点，分别位于N30、N33、N44、N51。为了研究各位点的糖基对GP5蛋白免疫特性的影响，本研究共构建了6个重组腺病毒，分别为表达野生型的GP5以及突变1-4个糖基化位点的突变体：rAd-GP5(wtGP5)、rAd-GP5N44S(N44S)、rAd-GPSN44／51S(N44／51S)、rAd-GPSN30／N44／51S(N30／44／51S)、rAd-GP5N30／N33／N44／51S(N30／33／44／51S)和rAd-GP5N30／N33S(N30／33S)。小鼠免疫试验结果为：5株表达GP5糖基化位点突变的重组体均可诱导产生较高水平的抗PRRSVELISA抗体，中和抗体水平明显高于野生型GP5重组腺病毒，说明，4个糖基化位点都能影响到GP5蛋白诱导中和抗体的能力。而且，rAd-GP5N30／N33S诱导的中和抗体滴度高于rAd-GP5N44S、rAd-GPSN44／51S、rAd-GPSN30／N44／51S，而低于rAd-GP5N30／N33／N44／51S，由于N30和N33残基上的糖基靠近GP5蛋白的非中和表位(aa27～30)，说明N30和N33这2个位点对诱导中和抗体非常重要。此外，野生型GP5和糖基化位点突变体诱导的淋巴细胞增殖应答没有明显的差异，说明，4个糖基化位点对GP5蛋白细胞免疫特性无明显影响。综上所述，PRRSV M与GP5、GP3与GP5、GP3和GP4与GP5蛋白融合表达后，能明显提高其诱导的中和抗体水平和细胞免疫应答；GP5蛋白的糖基化位点和非中和表位能明显影响其诱导中和抗体的能力；GP3蛋白具有较强的细胞免疫特性，从而为PRRSV重组腺病毒疫苗免疫候选分子设计提供了理论依据，为研究安全有效的PRRSV新型疫苗提供了新的思路和方法。