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由于当前检测碳酸酐酶活力方法的局限性,对碳酸酐酶活力大小的研究要远少于对其结构和功能方面的研究。但碳酸酐酶活力尤其是岩溶地区植物、微生物和土壤中碳酸酐酶活力的大小对研究生物与环境之间的关系以及元素的地球化学循环均有着重大的意义。本研究利用电化学传感技术结合全固态pH微电极替代了传统测量方法中的pH玻璃电极,对原有方法进行改进,并运用到植物及土壤碳酸酐酶活力的检测中。本研究的主要研究结果如下:
1.传统检测碳酸酐酶的pH计法使用的测量pH的工具是玻璃电极,玻璃电极用于测量一般静态下溶液的pH值较理想,但碳酸酐酶催化的可逆反应是一个快速的动态过程,传统的测定方法无法客观地反映出整个反应的pH变化。采用电镀法可以快速简便地制备出全固态的Sb/Sb2O3pH微电极,该pH微电极稳定性好,响应速度快,重现性高,pH值敏感性达到41.7mV/pH。与电化学方法中的开路电位法(OCP)相结合,解决了传统测定方法中的不足之处。
2.为了体现出电化学法测定的优点,将该方法测定的结果与传统pH计法进行比较,从对标准碳酸酐酶溶液及植物提取液中碳酸酐酶活力的测定结果比较来看,电化学法扩大了测量范围,提升了测量准确度,解决了原有方法在这些方面的缺陷。
3.基于上述电化学法的优点,将其运用到植物碳酸酐酶活力变化规律的研究中来。选取喀斯特先锋植物构树,广泛适生性植物桑树为研究对象,分别测定并绘制其碳酸酐酶活力的标准曲线,并测定出其碳酸酐酶胞外酶的活力范围。
4.通过在室内进行光照脱水及复水实验模拟构树、桑树遭受的干旱胁迫,测定此时碳酸酐酶活力的变化,分析两者抵抗干旱逆境的能力。构树在光照3小时,脱水60%以上仍能保持较高的碳酸酐酶活力,并在复水后恢复至原有水平。桑树在光照2小时内为了抵抗干旱逆境,碳酸酐酶活力有一定的上升,复水之后下降恢复至原有水平。在光照3小时以上,活力下降,复水后亦难以恢复。两者在光照4小时后,碳酸酐酶下降至原有活力的一半左右。这可能与其叶片细胞大量失水导致生理机能发生了不可逆的破坏有关。
5.通过不同浓度的聚乙二醇6000模拟水分胁迫以及同时添加碳酸酐酶胞外酶抑制剂AZ来探讨胞外酶在植物受到干旱逆境时所起的作用。结果表明,在聚乙二醇6000单独胁迫时,构树的碳酸酐酶活力未发生显著性变化,桑树的碳酸酐酶活力在中等浓度胁迫下有一定的上升,高浓度下有所下降。当加入AZ抑制胞外酶后,两者均不再对干旱胁迫有所响应,但胞内酶并未发生改变,表明胞外酶可能是调节植物在受到水分胁迫时的主要因素。
6.通过不同浓度的NaCl溶液模拟盐分引起的渗透胁迫以及同时添加碳酸酐酶胞外酶抑制剂AZ来探讨胞外酶在植物受到盐分逆境时所起的作用。结果表明,在NaCl溶液单独作用下,构树的碳酸酐酶活力均有所下降,桑树的碳酸酐酶活力在中等浓度时上升至最高峰,高浓度时有所下降。构树对Na+、Cl-的抑制常数低于桑树。当加入AZ抑制胞外酶后,两者均不再对盐分胁迫有所响应,但胞内酶仍不参与响应,表明胞外酶可能是调节植物在受到盐分胁迫时的主要因素。
7.将电化学法运用到土壤碳酸酐酶活力的测定中来。以温室中种植黄瓜的土壤为研究对象,测量黄瓜不同生育期时的土壤在不同深度下CO2浓度和碳酸酐酶活力,分析两者与土壤深度及两者互相之间的关系。温室土壤CO2浓度随土壤深度的增加而增加,碳酸酐酶活力随土壤深度的增加而减小。土壤碳酸酐酶活力与CO2浓度成反比相关。
综上所述,电化学法测定碳酸酐酶活力优于传统的pH计法,在实际测定应用中取得了较好的结果,可以将该方法推广到今后各类测定碳酸酐酶活力的研究应用中来。