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甘蔗是中国乃至世界主要的糖料与能源作物,是广西的支柱经济作物之一。在我国,近年来气候变化异常,出现极端最低气温,变化不稳定性增加,寒冷灾害更加严重。广西作为中国的甘蔗主产区,每年都会遭受不同程度的寒害冻害影响,给甘蔗生产和制糖工业生产造成巨大的经济损失。
本文采用土培桶栽甘蔗的方式种植甘蔗,用甘蔗品种ROC22幼苗进行叶片完整叶绿体的分离纯化以及叶绿体蛋白质提取方法的探索。然后,于正常生长(28℃)和低温胁迫(4℃)条件下,研究低温胁迫对不同抗寒性甘蔗品种ROC22、GT21和GT28幼苗的影响,测定甘蔗幼苗叶片的质膜透性,叶绿素荧光参数,叶绿体相关生理指标;运用蛋白质SDS-PAGE和双向电泳技术,分析低温胁迫下甘蔗品种ROC22幼苗叶绿体蛋白质的表达差异;进行综合分析以揭示低温胁迫下甘蔗幼苗叶绿体与低温胁迫的响应的有关机制,为甘蔗抗寒育种提供理论依据。主要结果如下:
1.利用蔗糖密度梯度离心法和Percoll梯度离心法对甘蔗品种ROC22幼苗叶片进行完整叶绿体的分离纯化,并且通过比较两种方法分离完整叶绿体并提取蛋白后进行SDS-PAGE电泳的效果。蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短,成本较低,所分离出的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点,并且提取的叶绿体蛋白电泳条带清晰,蛋白数量多且齐全。适合用于进行甘蔗完整叶绿体的分离纯化和进行蛋白质的提取。
2.在低温胁迫下,3个不同抗寒性甘蔗品种幼苗叶片的膜透性都显著增大;初始荧光(Fo)、非光化学淬灭系数(NPQ)显著上升,最大光能转化效率(Fv/Fm)、反应中心激发能捕获效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)、PSII实际量子效率((ф)PsnII)均下降,以ROC22下降幅度较大;叶绿体希尔反应活力、Mg2+ -ATPase、Ca2+ -ATPase活性下降,叶绿体中丙二醛(MDA)含量增加,以ROC22变幅较大;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性均上升,而GT28、GT21的增幅比ROC22显著。结果表明,低温胁迫对甘蔗幼苗叶绿素荧光参数、叶绿体相关生理指标有明显影响,而叶绿素荧光参数、叶绿体相关生理指标的变化与品种抗寒性密切相关,GT28和GT21抗寒性大于ROC22。
3.SDS-PAGE图谱分析结果表明,低温胁迫下,甘蔗品种ROC22叶绿体蛋白质条带发生了显著的变化,25.23kDa和22.03kDa处的蛋白质相对含量出现明显下调,14.25kDa处蛋白条带消失;31.64kDa和17.26kDa处蛋白相对含量显著增加,27.93kDa处新增一蛋白质条带。蛋白质双向电泳分析结果表明,低温胁迫下叶绿体蛋白质点下调的有6个,占60％;上调和新增的有4个,占40％;说明ROC22叶绿体蛋白质在低温胁迫下受到严重影响。