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【研究背景与目的】心肌炎是由多种病因引起的心肌的炎症性疾病,最常见的原因为病毒感染,其中以肠道病毒包括柯萨奇A,B组病毒,孤儿病毒,脊髓灰质炎病毒等为常见,尤其是柯萨奇B组病毒。据报道,大多数急性心肌炎病人在病毒感染后3周内会出现心电图的异常,包括ST-T改变和各型心律失常,特别是室性心律失常尤为常见,但是其确切的心电生理或分子机制尚不明确。故本研究通过构建柯萨奇病毒B3感染大鼠心室肌细胞模型,观察该病毒对新生大鼠心室肌细胞形态及结构的影响,了解病毒对心室肌细胞的直接损伤作用;记录感染柯萨奇病毒B3后心室肌细胞L型钙电流的变化,探讨病毒性心肌炎室性心律失常发生的细胞电生理机制;检测柯萨奇病毒B3感染培养大鼠心室肌细胞L型钙通道各亚单位mRNA及蛋白的表达,探讨病毒性心肌炎室性心律失常发生的分子机制,以期为临床上对病毒性心肌炎心律失常发病机制的理解及其治疗提供新的思路。【方法】(1)回顾性分析127例病毒性心肌炎患者的心电图表现,观察各类心律失常的发生情况;(2)构建病毒性心肌炎的细胞感染模型:取1-3口龄新生SD大鼠进行心室肌细胞原代培养,用柯萨奇病毒B3 Nancy株感染培养48小时已呈规律搏动的心室肌细胞,观察病毒感染前后细胞形态、搏动百分比和超微结构改变,监测培养液上清中肌酸激酶浓度的改变,逆转录聚合酶链式反应检测感染细胞及其上清液中是否存在病毒RNA。(3)电生理试验:感染病毒24小时,细胞尚未出现明显病变时,取正常组和病毒感染组心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术分别记录两组细胞的L-型钙电流,观察病毒感染前后细胞膜电容,电流密度,电压依赖性激活和失活等动力学参数的改变。(4)逆转录聚合酶链反应:同批培养的心室肌细胞接种柯萨奇病毒B3后,采用逆转录聚合酶链反应技术,测量病毒感染前后L型钙通道各亚单位mRNA表达量的变化。(5)抗体的制备、纯化以及免疫印迹:采用固相合成法合成心肌细胞L型钙通道各亚单位的肽段,免疫动物,分离因清,经鉴定后采用饱和硫酸铵盐析提纯制备得到抗-大鼠心室肌细胞L型钙通道各亚单位的多克隆抗体,采用免疫印记技术测量病毒感染前后L型钙通道各亚单位蛋白表达量的变化。【结果】(1) 127例病毒性心肌炎患者中,肠道病毒阳性114例,其中柯萨奇病毒抗体阳性79例,阳性率62.20%。79例柯萨奇病毒抗体阳性心肌炎患者,动态心电图记录到心律失常64例,约占81.01%,其中房性早搏或房性心动过速8例(12.5%),交界性早搏2例(3.13%),室性早搏或室性心动过速28例(43.75%),房室传导阻滞19例(29.69%)。(2)正常培养的新生SD大鼠心室肌细胞呈规律性搏动,感染柯萨奇病毒B3 48小时后,细胞搏动逐渐减慢,并逐渐出现变圆、扁缩等细胞病变,最终细胞停止搏动,自盖玻片上脱落、死亡;电镜下观察可见细胞内溶酶体增多,线粒体空泡变性,核膜破裂等超微结构改变;感染细胞的上清培养液中CK-MB的浓度较正常组明显增高,同时感染细胞内及上清液中均可检测到病毒RNA及其结构蛋白基因片段的存在。(3)全细胞膜片钳记录显示,正常组与病毒感染组心室肌细胞膜电容无显著差异(43.30±5.08pF vs 44.50±5.01pF,P=NS,n=20),但感染组心室肌细胞L-型钙电流的平均电流密度在20-+10mV的测试电压范围内显著高于正常组细胞(P<0.05 vs control,n=7),在0mV,峰电流密度增加25.74%(P<0.05,n=7),但电压依赖性的通道激活及失活动力学过程在病毒感染前后无显著改变。(4)逆转录聚合酶链反应结果提示,病毒感染组心室肌细胞L型钙通道α1c和β2亚单位mRNA的表达量较正常对照组明显增多(P<0.01 or P<0.05 vscontrol),而α2/δ亚单位mRNA表达量的改变无统计学意义。(5)免疫荧光细胞化学结果显示,制备的抗大鼠心室肌细胞L-型钙通道α1c、pz和α2/6亚单位的三个抗体均能特异性的与培养大鼠心室肌细胞膜结合,进一步经免疫印记实验证实,病毒感染组心室肌细胞L型钙通道α。c和β2亚单位的蛋白表达量较之正常组细胞显著增加(P<0.01 vs control,n=8),α2/δ亚单位的表达无显著改变。【结论】(1)病毒性心肌炎可导致各种心律失常的发生,其中以室性心律失常最为常见;(2)柯萨奇病毒B3感染对体外培养的心室肌细胞可以产生直接的损伤作用,因而可作为体外研究病毒性心肌炎的细胞模型;该病毒感染心室肌细胞后使细胞膜L型钙电流明显增大,L型钙通道功能性α1c亚单位和调节性β2亚单位在转录以及翻译水平的表达均明显上调,病毒性心肌炎室性心律失常的产生可能与上述病理改变有关。