【摘 要】
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分离缺陷基因PAR6(partitioning defective 6)主要包括PARD6A、PARD6B和PARD6G三种亚型,最初是在秀丽线虫中发现的,它们所编码的PAR6蛋白是一种重要的极性分子,在果蝇、爪蟾
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分离缺陷基因PAR6(partitioning defective 6)主要包括PARD6A、PARD6B和PARD6G三种亚型,最初是在秀丽线虫中发现的,它们所编码的PAR6蛋白是一种重要的极性分子,在果蝇、爪蟾、小鼠等生物体内都有其同源物存在。为了探究其在猪卵母细胞体外成熟过程中的作用,本试验首先采用RT-PCR技术从猪卵巢组织中克隆出了PARD6A、PARD6B基因,构建了pPARD6A-Venus和pPARD6B-Venus真核表达载体,将构建成功的载体转染Hela细胞予以验证;其次通过体外转录将pPARD6A-Venus和pPARD6B-Venus转录成为RNA,通过显微注射技术分别将其注射到猪卵母细胞中,在体外培养成熟后统计第一极体排出率;再次,通过免疫荧光染色方法分别对猪卵母细胞GV、GVBD以及MⅡ期进行染色,探究PARD6A在猪卵母细胞成熟过程中的定位;最后,将PARD6A抗体显微注射到猪卵母细胞中,体外成熟培养后统计第一极体排出率。研究取得如下结果:1.通过RT-PCR从猪卵巢组织中克隆出了PARD6A、PARD6B的CDS区,并连接到p-Venus真核表达载体上,构建pPARD6A-Venus和pPARD6B-Venus真核表达载体,经过双酶切鉴定后送测序公司测序,表明载体构建正确。将该载体转染到Hela细胞,发现其在Hela细胞中的表达,产物未表现出明显的极性定位现象。2.通过体外转录将pPARD6A-Venus和pPARD6B-Venus真核表达载体转录成RNA,分别将两种RNA显微注射到GV期猪卵母细胞中,进行体外成熟培养,观察统计结果表明,两者对猪卵母细胞的第一极体排出率均无显著影响。3.通过对猪卵母细胞GV期、GVBD以及MII期的免疫荧光染色,发现PARD6A蛋白在猪卵母细胞第一次减数分裂过程中没有表现出明显的极性分布现象,并且其定位也没有随着猪卵母细胞的体外成熟过程发生明显的变化。4.对猪卵母细胞显微注射PARD6A的单克隆抗体之后,其第一极体排出率明显下降。结论:成功构建了pPARD6A-Venus和pPARD6B-Venus真核表达载体;过表达PARD6A或PARD6B对体外培养的猪卵母细胞的第一极体排出率无显著影响;PARD6A在猪卵母细胞体外成熟过程中未表现出明显的极性定位;干扰PARD6A蛋白会降低猪卵母细胞体外成熟培养时的第一极体排出率。
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