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甲藻是间核生物,有毒的甲藻通过其特殊的代谢途径可产生独特结构的甲藻毒素,是潜在的新药开发资源。慢原甲藻是一种有毒甲藻。从我国南海三亚海域获得的慢原甲藻(Prorocentrumrhathymum)藻种,属国内首次记录并在实验室成功进行人工培养,对其生长和产毒的研究几为空白。因此本论文研究了其生长、毒性以及产毒调控。
研究了慢原甲藻在f/2、f、K、2K、ES、2ES培养基中,f培养基最利于慢原甲藻的培养。
研究了温度、盐度、光照、起始密度、大量元素、微量元素、维生素等7个单因子对该藻种生长的影响。结果表明,慢原甲藻的适宜生长条件为温度20℃-30℃、盐度30‰-40‰、光照67.5μmol·m-2·s-1-121.5μmol·m-2·s-1、起始密度1000cells·mL-1-8000cells·mL-1,大量元素浓度、微量元素浓度、维生素浓度分别为f培养基对应组分的1/2-2倍、1/8-1/2倍、1/2-4倍。在单因子实验中,慢原甲藻的最适生长条件为温度25℃、盐度35‰、光照94.5μmol·m-2·s-1、起始密度8000cells·mL-1,大量元素浓度、微量元素浓度、维生素浓度分别为f培养基的1/2、1/4、2倍。
为得到慢原甲藻高密度生长的最佳起始密度与改良培养基,设计了起始密度与大量元素、微量元素、维生素的四因素三水平正交实验,并考虑了起始密度与营养盐之间可能存在的交互作用。实验结果显示,起始密度为4000cells·mL-1、维生素浓度为f/2培养基的4倍时适合慢原甲藻的高密度生长。由于温度、盐度、光照对慢原甲藻生长的影响可能有交互作用,因此通过温度、盐度、光照的全因子析因实验,明确了慢原甲藻最佳生长的物理环境因子组合。使用正交实验得到的改良培养基为培养基,当温度25℃、盐度40‰、光照94.5mol·m-2·s-1,培养11天后达到最大细胞密度11.8×104cells·mL-1。在温度30℃、盐度40‰、光照94.5μmol·m-2·s-1的条件下,慢原甲藻在培养的第9天达到最大细胞密度10.9×104cells·mL-1,此时生长率最大,为0.531division·d-1。
探索了南海慢原甲藻的生物毒性,对其进行了卤虫毒性、小白鼠毒性、斑马鱼急性毒性、血细胞溶血性以及腹泻性贝毒的试验。结果表明,我国南海的慢原甲藻对卤虫、小白鼠没有明显毒性作用;对斑马鱼有显著的毒性,当每毫升水体含5万个藻细胞提取液时,斑马鱼的致死率可达100%;单位细胞溶血活性为4.8×10-7HU·cell-1;慢原甲藻的细胞内与其胞外培养液均被检测出含有腹泻性贝毒大田软海绵酸(OA)。单位细胞OA含量在指数期最高,单位体积胞内OA含量在稳定期最高。
温度、盐度、光照均是显著影响慢原甲藻产毒的环境因子。温度对慢原甲藻单位细胞毒素含量以及单位体积胞内毒素含量影响最大。慢原甲藻单位细胞产毒最大与单位体积胞内产毒最大的条件一致,均为温度25℃、盐度30‰、光照67.5μmol·m-2·s-1的组合,该条件下单位细胞OA含量为38.1fg·cell-1,单位体积胞内OA含量为1057.6pg·mL-1。慢原甲藻的最佳生长条件与产毒条件不一致,且生长率与单位细胞的毒素含量无显著相关性。