转录因子介导的DNA被动去甲基化的分子机制研究

• 作 者: 蒋小琴
• 出 处: 华东师范大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: DNA甲基化 重编程 被动去甲基化 UHRF1 四因子 NANOG

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,在细胞分化、胚胎发育、疾病发生等方面扮演着重要角色。体细胞重编程为具有多能性的胚胎干细胞样细胞(iPS)在很多疾病的病理学研究以及再生医学方面具有重要的应用价值。重编程过程伴随DNA甲基化修饰谱式的改变,包括DNA的去甲基化。DNA去甲基化可以分为主动去甲基化和被动去甲基化。DNA主动去甲基化方式就是在TET酶的催化下,DNA上的5-甲基胞嘧啶氧化形成5-羟甲基胞嘧旋,再通过进一步的氧化作用以及TDG介导的DNA碱基切除修复途径,生成未修饰的胞嘧啶,从而使DNA发生主动去甲基化。DNA被动去甲基化,就是指在DNA复制过程中DNMT1不能正常行使DNA维持性甲基化的功能,导致DNA复制后新合成的DNA没有发生甲基化修饰,并随着细胞增殖所伴随的DNA再次复制,其原有的DNA甲基化修饰就会丢失,从而导致被动去甲基化的发生。目前对于被动去甲基化的分子机制研究甚少,其作用机制仍尚未明确。因此,开展DNA被动去甲基化分子机制的研究工作,有助于我们更加深入、全面地了解iPS过程的作用机制,同时也有助于我们深入了解干细胞与分化细胞的基因表达及甲基化谱式的差异的原因,从而有助于人们更好地将iPS利用到生命医学研究的各个领域。本研究以iPS相关的重要转录因子-四因子(OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC)以及NANOG为代表,探究了这些转录因子是否参与DNA被动去甲基化及其调控DNA被动去甲基化的分子机制。目前研究表明由DNMT1介导的DNA维持性甲基化取决于辅助因子UHRF1与半甲基化DNA的结合。通过利用大肠杆菌纯化的蛋白与小片段顺序特异性的DNA进行体外结合反应,我们发现了 C-MYC与NANOG都能结合特定序列的半甲基化DNA,并且C-MYC能够与UHRF1竞争性地结合半甲基化DNA,而NANOG有效抑制UHRF1与半甲基化DNA的结合;此外,OCT4、SOX2、KLF4也能在体外反应中抑制UHRF1与半甲基化DNA的结合。通过Co-IP实验,我们发现四因子以及NANOG与UHRF1有微弱的相互作用,并且分别将四因子以及NANOG与UHRF1共转染,都会降低UHRF1的染色质定位。这些结果表明这些重要的转录因子(尤其是NANOG)在体内很有可能参与DNA复制依赖的被动去甲基化。此外,我们利用DNMT3A/3B双敲除的HeLa细胞进行甲基化免疫染色实验,发现单转NANOG、OCT4均会导致整体基因组DNA甲基化水平明显下降;而单转SOX2、KLF4则对5mC水平没有明显影响。通过免疫染色发现,单转NANOG、OCT4会导致内源DNMT1蛋白水平受到不同程度的下调。我们的研究提示就表明干细胞核心转录因子可能通过至少两种途径调控基因组甲基化水平下降,其一是通过抑制UHRF1与半甲基化DNA的结合;其二是通过影响DMNT1的表达。