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本文对固定化青霉素酰化酶拆分DL-丙氨酸和DL-亮氨酸的工艺条件以及酶学性质进行了研究,并探讨了高效液相色谱检测丙氨酸的苯乙酰化衍生物--N-苯乙酰-丙氨酸条件的优化。
D-丙氨酸和D-亮氨酸是重要的医药化工原料,在医药,食品,化妆品等领域有广泛的应用。D-丙氨酸可阻止体内脂质氧化损伤,清除细胞毒性。还可以抑制致癌物质二甲基亚硝胺(DMNA)的生成。在食品添加剂方面,D-丙氨酸合成的二肽甜味剂阿力甜,甜度是蔗糖的2000倍,而热量仅为蔗糖的0.02%[4]。在化妆品方面,D-丙氨酸有抑菌作用,而且是自然保湿因子(NMF)的主要成分,是角质层保持水分的重要角色。D-Leu参与组入的多粘菌素E对革兰氏阴性菌,特别是绿脓杆菌有强大的杀菌作用。
对固定化青霉素酰化酶拆分上述两种氨基酸的热力学及动力学的研究表明,对于N-苯乙酰-DL-丙氨酸,最适pH为8.5,最适温度为47℃,最佳Co2+浓度为1×10-3mol/L;对于N-苯乙酰-DL-亮氨酸,最适pH为7.5,最适温度为42℃,最佳Co2+浓度为1×10-3 mol/L。本文还测定了固定化青霉素酰化酶在32℃,37℃,42℃条件下对两种氨基酸拆分的动力学参数Km(米氏常数),Vm(最大反应速度),Kis(表观底物抑制常数),Kip(表观产物抑制常数)。
本文还对固定化青霉素酰化酶拆分DL-丙氨酸、DL-亮氨酸制备相应的D型氨基酸的制备工艺进行了优化,D-丙氨酸总收率为84.0%,光学纯度为95.3%。D-亮氨酸总收率为76.1%,光学纯度为96.8%。
最后,高效液相色谱检测N-苯乙酰-丙氨酸条件优化的研究表明,在流动相为A液:10%甲醇溶于20mmol/L磷酸二氢钠;B液:甲醇;A:B=65:35,流速为0.7mL/min,检测波长为257nm,检测温度为35℃时,N-苯乙酰-丙氨酸与苯乙酸能被有效地分离,N-苯乙酰-丙氨酸的含量能被准确地求出。