论文部分内容阅读
鳜是我国重要的水产养殖鱼类，开展其分子免疫的研究不仅具有理论意义，而且具有重要的应用价值。本论文对鳜参与呼吸爆发的两个重要的酶—髓过氧化物酶（MPO）和NADPH氧化酶的cDNA进行了克隆，并对髓过氧化物酶部分重链（第279-694个氨基酸）进行了原核表达。 利用RACE-PCR及同源克隆方法，克隆到鳜MPO及NADPH氧化酶的5个亚基（gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox、p40phox）cDNA全长。MPO cDNA全长3345nt,开放阅读框（ORF）2292nt,编码763个氨基酸，序列相似性分析发现其与哺乳动物MPO相似性较低，但是具有相似的分子量大小，含有一个与人MPO相似的血红素基，一个保守的Ca2+结合位点，6个分子内二硫键，以及6个糖基化位点，推测鳜MPO蛋白的空间结构及催化机制可能与哺乳动物相似。gp91phox开放阅读框为1698nt，翻译成565个氨基酸；N端形成6个转膜区，有3个糖基化位点，存在2个血红素基：p22phox开放阅读框561nt，翻译成186个氨基酸，N端形成3个跨膜区，C端有一个富含脯氨酸的PRR区；p67phox开放阅读框1488nt，翻译成495个氨基酸，p67phox蛋白包括4个TPR基序、一个PB1结构域和两个SH3结构域；p47phox开放阅读框1209nt，翻译成402个氨基酸，包括1个PX区域1个SH3区域；p40phox开放阅读框为1050nt，可翻译成349个氨基酸，含有1个PX区域一个SH3区域。虽然鳜鱼的这些亚基序列与人的对应体相似性较低，但是它们具有同样的高度保守的结构和功能域。由此认为鳜鱼的NADPH氧化酶与人的NADPH氧化酶具有相似的功能。 选择鳜MPO部分cDNA片段（第279-694氨基酸）设计含有酶切位点的表达引物，构建重组表达质粒，经过IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE分析表达产物。结果表明重组的MPO在大肠杆菌中以包涵体形式获得了表达，产物为59KDa的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析和切胶回收的方法对表达的蛋白进行了纯化，制备了兔抗重组MPO的抗血清。经Westernblotting分析，重组MPO表达产物能够被兔多克隆抗体特异性识别：用兔多克隆抗体在鳜肝脏、头肾、肌肉、肠等均能检测到MPO表达产物；用MPO抗体孵育鳜血细胞涂片，然后DAB显色，可特异性显示鳜嗜中性粒细胞。