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目的:胃癌是危害人们健康的重要疾病之一,是世界第五大常见癌症,在肿瘤相关死亡中居于第3位,严重影响危害人类的生命与健康。就中国而言,胃癌发病率仅次于日本和韩国,全球约42%的胃癌患者都居于中国。目前,虽然胃癌的诊疗水平与技术已经有一定程度的改善和提高,但胃癌患者的预后依然未能让人满意。胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多阶段的过程,涉及大量分子与细胞的参与及复杂的网络调控。因此探究胃癌发生及进展中的关键生物学分子指标,同时使其适用于临床进展期胃癌的诊断、治疗及复发预防,是当前提高胃癌患者预后的关键所在。原钙粘蛋白10(PCDH10)是原钙粘蛋白细胞粘附分子家族的成员之一,能够参与真核细胞的许多分子事件,包括细胞分类和识别、边界形成、诱导和细胞粘附等,是重要的抑癌基因。早期关于PCDH10的研究主要关注神经生理方面,认为原钙粘蛋白10(PCDH10)在大脑发育中发挥了重要作用。PCDH10是近年来被用以检测人恶性肿瘤发生和进展的新指标,在多种恶性肿瘤组织(结直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌及子宫内膜癌等)均发现PCDH10表达低下且与肿瘤细胞的增殖侵袭等恶性生物学行为密切相关。因此探讨PCDH10在胃癌中是否对细胞功能产生影响,同时研究PCDH10如何调控细胞生物学功能改变的具体机制具有重要意义。本课题的研究内容主要是检测胃癌及对应癌旁组织中PCDH10 m RNA及蛋白水平的表达及变化;分析PCDH10表达水平与患者临床病理特征之间的关系;检测PCDH10在人不同胃癌细胞株(MGC-803、HGC-27、SGC-7901、SUN-1、BGC-823、AGS和KATO-III)和人正常胃黏膜细胞(GES-1)中的表达差异;另外,通过质粒在胃癌细胞株中过表达PCDH10后进行细胞增殖、迁移、侵袭等相关功能学实验,进一步明确PCDH10基因对胃癌细胞生物学行为的影响。方法:1.随机选取2003年6月~2007年6月间就诊于天津医科大学肿瘤医院胃部肿瘤科接受胃癌根治手术,术后病理确诊为胃癌的患者69例,收集患者术后组织蜡块和完整的临床随访资料,并于我院病理科切片。应用免疫组化的方法对组织标本进行染色,检测PCDH10的蛋白表达水平,对免疫组化结果进行判定评分,分析PCDH10在胃癌与癌旁正常组织中的表达差异;并探讨PCDH10基因表达水平与胃癌临床病理特征及预后的关系及临床意义。2.PCDH10基因对胃癌细胞增殖、迁移、凋亡以及细胞周期的影响。选取胃癌细胞系MGC803及HGC27作为实验研究对象,进行CCK8(Cell Counting Kit-8)以及克隆形成实验明确基因PCDH10对胃癌细胞增殖能力的影响;划痕实验探讨基因PCDH10对胃癌细胞迁移能力的影响和作用;Transwell实验了解基因PCDH10对胃癌细胞侵袭能力的影响;流式细胞术(凋亡和细胞周期实验)探究基因PCDH10对胃癌细胞周期和凋亡的影响。3.RT-PCR验证PCDH10对Bcl-2,MMP-2,HGF,VEGF-A以及VEGF-C的作用:选取胃癌细胞MGC803和HGC27作为研究对象,转染空载体质粒及过表达PCDH10质粒,应用半定量逆转录聚合链反应技术的方法检测Bcl-2,MMP-2,HGF,VEGF-A以及VEGF-C的表达情况。4.体内实验皮下注射移植瘤动物模型的建立,探索PCDH10对胃癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响及相关肿瘤细胞生物学特性及基因表达差异。5.Western Blot和RT-PCR实验简单验证过表达RNF180对PCDH10的影响。我们选取胃癌细胞MGC803及HGC27作为研究对象,分别转染过表达质粒RNF180及相对应的空载体质粒,应用半定量逆转录聚合链反应技术及Western blot方法检测PCDH10的表达情况。结果:1.免疫组化结果显示:PCDH10在胃癌组织中表达明显低于癌旁正常组织;在胃癌组织标本中PCDH10蛋白表达的阳性率为20.3%(14/69);在癌旁正常组织中PCDH10蛋白表达的阳性率为53.6%(37/69),PCDH10在胃癌中的阳性表达率较其在癌旁正常组织低,结果有统计学差异(c2=20.803,P<0.001)。进一步将PCDH10的表达水平与胃癌临床病理特征及患者预后进行统计学分析,结果显示:PCDH10蛋白阳性表达的患者较PCDH10蛋白阴性表达患者存活时间长(49 vs 29个月,p=0.006)。PCDH10蛋白的阳性表达以及Lauren分型可以作为胃癌的独立预后预后预测因子(HR=2.784,P=0.009)。淋巴结转移数目(p N期)与PCDH10表达具有相关性(p=0.033),随着淋巴结转移数目的增加,胃癌患者肿瘤组织中PCDH10表达阳性率明显降低(p N1患者50%,p N2患者30%,p N3a患者20%,p N3b患者0%,P=0.033)。2.通过半定量逆转录聚合链反应技术检测PCDH10 m RNA在人胃癌细胞株(MGC-803、HGC-27、SGC-7901、SUN-1、BGC-823、AGS和KATO-III)中的表达水平均低于人正常胃黏膜细胞GES-1(P<0.05);通过Western blot技术检测PCDH10蛋白在人胃癌细胞株(MGC-803、HGC-27、SGC-7901、SUN-1、BGC-823、AGS和KATO-III)中的表达水平均低于人正常胃黏膜细胞GES-1(P<0.05)。3.CCK8以及克隆形成实验表明基因PCDH10能够抑制胃癌细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell实验证实了基因PCDH10可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力;流式细胞术(细胞凋亡和细胞周期实验)结果表明基因PCDH10可以促进胃癌细胞的凋亡,并可以诱导胃癌细胞的G1期阻滞。4.RT-PCR实验证实与对照组(空载体转染)相比,转染PCDH10过表达质粒的胃癌细胞组(MGC-803-GFP–PCDH10及HGC27-GFP-PCDH10)基因Bcl-2,MMP-2,HGF,VEGF-A以及VEGF-C表达下调。进而说明过表达PCDH10可以抑制Bcl-2,MMP-2,HGF,VEGF-A以及VEGF-C的表达。5.体内实验(皮下注射移植瘤动物模型的建立)结果显示:过表达基因PCDH10组的裸鼠肿瘤平均直径明显小于对照组(转染空载质粒),进而表明基因PCDH10在胃癌中确实有抑癌作用。6.Western Blot和RT-PCR实验证实与对照组(空载体转染)相比,无论在蛋白水平还是m RNA水平转染RNF180过表达质粒的胃癌细胞组(MGC-803-GFP–RNF180及HGC27-GFP-RNF180)后PCDH10表达上调。说明过表达RNF180可以增强PCDH10的表达。结论:1.PCDH10的表达与胃癌的发生发展相关,由此推测PCDH10在胃癌的发生发展中起一定作用。2.PCDH10在胃癌组织中表达明显低于癌旁正常组织。生存分析发现在胃癌组织中PCDH10的表达情况与患者生存密切相关。淋巴结转移数(p N期)与PCDH10表达具有相关性,因此PCDH10蛋白表达可作为胃癌患者预后的预测指标之一。3.PCDH10通过抑制胃癌细胞的几种生物学事件(包括增殖,活力,侵袭,迁移,抗凋亡和肿瘤淋巴管生成)发挥其抑制胃癌细胞淋巴结转移的作用。4.RNF180可作为一种新的生物标志物,提高胃癌淋巴结转移预测的准确性。本研究推测PCDH10受到RNF180的调控,可能是RNF180抑制胃癌细胞淋巴结转移的机制中重要参与分子,具体调控机制还不明确,有待后续实验进一步探究明确。