论文部分内容阅读
tat-1编码P4类ATP水解酶，负责维持磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）在细胞膜上的不对称分布。在tat-1突变体的肠细胞中有很多巨大的空泡状结构和GFP::LGG-1形成的聚集体。为了进一步研究TAT-1在内吞作用和自噬过程中的作用以及寻找更多的调控因子，我们用携带有GFP::LGG-1转基因的tat-1突变体qx30为遗传背景，用EMS诱变的方法筛选能抑制或者增强这种泡状结构或GFP::LGG-1聚集的突变体，共得到了8个抑制型突变体和5个增强型突变体。 qx66和qx111是其中的两个增强型突变体，它们都不能抑制tat-1突变体肠细胞中的空泡状结构，反而进一步增强GFP::LGG-1在肠细胞中形成大片状的聚集。它们是由同一个基因laat-1（lysosomal amino acid transporter-1）突变导致的。 我们发现LAAT-1编码定位在溶酶体膜上的碱性氨基酸转运蛋白，负责把溶酶体内的精氨酸和赖氨酸从溶酶体转运至细胞质。LAAT-1功能的缺失会导致大量的精氨酸和赖氨酸累积在溶酶体内，导致细胞质内这两种必需氨基酸的缺乏，从而引起线虫胚胎发育迟缓。而且LAAT-1功能的缺失会导致严重的溶酶体降解缺陷，包括凋亡细胞，自噬和内吞底物以及卵黄蛋白的降解都出现了明显的缺陷。体外实验表明LAAT-1和人类的同源蛋白PQLC2具有转运精氨酸、赖氨酸和组氨酸的活性。人的CTNS基因突变会导致胱氨酸贮积症(cystionsis)，而半胱胺(cysteamine)是治疗这种疾病的药物，但是它具体的治疗原理并不清楚。前期的研究表明半胱胺和半胱氨酸可缩合生成类似赖氨酸的小分子DCC(disulfide of cysteine and cysteamine)，而后者可作为赖氨酸类似物通过赖氨酸通道转运出溶酶体，从而使溶酶体胱氨酸含量降低。线虫的CTNS-1是CTNS的同源蛋白，我们发现LAAT-1的功能对于半胱胺抑制ctns-1突变体溶酶体变大和减少胱氨酸在溶酶体内累积是必需的，而DCC被发现累积于laat-1ctns-1双突变体的溶酶体内。体外实验表明LAAT-1和PQLC2都具有转运DCC的活性。我们推测PQLC2可能对于半胱胺治疗胱氨酸贮积症具有重要作用。 我们从tat-1增强子/抑制子筛选中得到调控自噬的基因atg-16.1(qx57)，atg-162(qx67)和atg-7(qx68)。我们发现上述基因的突变只能抑制tat-1突变体肠细胞中的GFP::LGG-1聚集但不能抑制空泡状结构。 haf-4(qx56)，haf-9(qx93)和R07E3.1(qx71)是三个抑制型突变体，它们不仅抑制tat-1突变体肠细胞中的GFP::LGG-1聚集，而且抑制那些不正常的泡状结构。我们发现这三个基因都特异表达在肠细胞中，HAF-4和HAF-9是定位在肠道颗粒(gutgranule)膜上的ABC转运蛋白(ATP-binding cassette(ABC) transporter），而R07E3.1是定位在肠道颗粒内部的一个蛋白水解酶。这3个突变体都不能回复由于tat-1突变导致的PS在细胞膜上的对称分布。