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酵母絮凝是一种无性的、钙依赖的细胞相互凝聚形成絮凝物的过程。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的絮凝是由遗传背景决定的,FLO家族基因编码的细胞表面糖蛋白通过和其他细胞表面的寡聚甘露糖链之间相互作用,使酵母细胞之间相互聚集形成颗粒或絮状物,即产生絮凝表型或类似生物膜的结构。絮凝基因FLO1是酿酒酵母中最为典型的含有大量基因内重复序列的基因。FLO1基因内含有四个重复序列单元(即重复序列单元A、B、C和D),分别重复18次、2次、3次和3次。酵母细胞在DNA复制过程中,大量重复序列的存在使得FLO1基因极易发生同源重组从而导致基因序列缺失引发絮凝特性的不稳定性,但目前对FLO1基因内重复序列中哪些位点是同源重组的热点还很不清楚。
本研究通过融合PCR方法构建了FLO1中全部重复序列单元A发生缺失的衍生基因FLO1α,以含有FLO1基因的大肠杆菌和酿酒酵母为筛选模型,通过连续传代培养及质粒快速分析获得29个FLO1内重复序列单元A不同程度、不同位点缺失的衍生基因FLO1α1-FLO1α29。完整FLO1基因和衍生基因FLO1α、FLO1α1-FLO1α5转化非絮凝型酵母YS58,得到重组菌株YSF1、YSF1a及YSF1a1-YSF1a5,分析了上述不同酵母菌株絮凝特性及其遗传稳定性。絮凝基因FLO1中重复序列单元A完全缺失使酵母细胞完全失去絮凝能力,部分重复序列单元A发生缺失导致絮凝能力降低,絮凝基因中重复序列单元A的拷贝数与细胞絮凝能力成正相关,但不是简单的数量关系。其中衍生基因FLO1α3含有的重复序列单元A是FLO1基因的33.3%,但菌株YSF1a3的絮凝能力可达YSF1絮凝能力的71.4%。而且菌株YSF1a3的絮凝特性比菌株YS目的絮凝特性具有更好的环境适应性和遗传稳定性。测序分析衍生基因FLO1α1-FLO1α29发现,这些衍生基因分别在不同位点缺失了不同个数的重复序列单元A。在酵母细胞连续培养过程中FLO1基因内重复序列单元A之间发生了重组,产生重复序列单元A不同程度缺失的衍生基因,导致细胞絮凝能力的改变。初步确定Al可能是同源重组易发热点区域,且+948位点(即Al的117位核苷酸)可能是FLO1内同源重组热点。重复序列单元A是絮凝基因中非常活跃的序列,是导致絮凝特性遗传不稳定的关键因素,该序列的部分缺失不但可以使酵母细胞呈现适度的絮凝能力,而且使絮凝特性具有更好的环境适应性和遗传稳定性。该研究为通过对絮凝基因内衔接重复序列的合理调控,促进酵母絮凝特性在发酵工业及其他生物化工过程和环境修复中的广泛应用提供了重要的理论依据和解决策略。