香蕉在低氮胁迫下的基因差异表达研究

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香蕉是重要的热带水果,营养丰富,深受消费者喜爱,香蕉种植产业经济效益好,经济地位重要。氮素是植物重要的大量营养元素,是构成蛋白质的主要成分之一,而蛋白质还是细胞膜、细胞质、细胞核等细胞结构的重要组成部分,绝大数的酶也是蛋白质。香蕉株型高大,果实硕大,生产中需要大量的氮素营养供应。当前,香蕉的栽培通常采用大水大肥的模式,虽然保证了香蕉的产量,但是氮素的利用率不高,造成了严重的养分流失、环境污染和土壤恶化。如何提高植物的氮素利用效率,减少氮肥施用量,是重要的理论和实践问题。为了研究香蕉对低氮胁迫响应的分子机制,筛选香蕉氮代谢相关的重要基因,本研究在香蕉苗期进行了低氮胁迫处理实验,测定相关的生理指标,并借助第二代高通量测序技术对对照和低氮处理的香蕉叶片与根系进行了转录组测序,筛选香蕉在低氮胁迫下的差异表达基因,并对重要基因进行深入功能分析。本研究取得的主要结果如下:1、以巴西蕉组培苗为实验材料,通过营养液沙培法,进行低氮胁迫实验。观察并记录了植株在对照和低氮条件下的株高与叶片黄化程度,评价低氮对香蕉幼苗的生长影响。结果低氮胁迫实验60天后,在对照与低氮组之间,植株叶片数、株高、地上鲜重、地上干重、地上总含氮量、地下总含氮量差异显著,地下鲜重、地下干重差异不显著。2、分别取对照处理植株的地上部分CL、地下部分CR,低氮处理植株的地上部分NL、地下部分CR,进行RNA-Seq测序,经数据过滤,分别获得12121980、12127542、12121219、12111330 个 clean reads。以 FDR≤0.001 且|log2Ratio|≥1为差异表达基因的筛选条件,将对照组地上部分CL和低氮组地上部分NL的测序结果进行对比,筛选出29380个差异表达基因;将对照组地下部分CR和低氮组地下部分NR的测序结果进行对比,筛选出31169个差异表达基因。在此基础上再使用PPEE<0.05为显著差异筛选标准,结果CL-VS-NL中共有1413个显著上调基因和652个显著显著下调基因;CR-VS-NR共有497个显著上调基因和692个显著下调基因,150个基因同时在叶片与根系显著差异表达,其中36个在叶片与根系中均上调;43个均下调;51个在叶片中上调,在根中下调;20个在叶片中下调,在根中上调。3、对差异基因进行Gene Ontology分析,两组差异基因分别与44和36个生物功能有关;通过Pathway分析,共富集到114和106个代谢通路。4、随机从显著差异基因中选取20个进行荧光定量PCR(qRT-PCR),结果显示其中16个基因的差异表达情况与测序结果接近,整体变化趋势一致,说明测序结果基本可靠。5、从显著差异基因中,筛选出硝酸盐转运蛋白基因MaNRT2(GSMUAAchr8T14230001)和WRKY转录因子基因MaWRKY2(Ma01g18830);克隆得到两个基因的CDS全长,并进行氨基酸理化性质、蛋白质结构域及功能域、磷酸化位点、系统进化树等预测和分析。6、构建遗传转化载体 pCAMBIA 99-1-MaNRT2-3-HA 和 pCAMBIA 99-1-MaWRKY2-3-HA,采用农杆菌介导、浸泡柱头法转化野生型拟南芥,使用含有相应抗生素的培养基筛选并通过PCR鉴定转基因植株。
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