论文部分内容阅读
目的:研究绞股蓝总苷(gypenosiedes，GP)对高脂诱导的血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells，VSMCs)去分化的影响及分子机制，探讨GP抗动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的细胞分子机制。 方法: 第一部分:动物水平实验:采用高脂饲料喂饲建立高脂大鼠模型。实验中分别采用GP160.0 mg/kg/d剂量灌胃，辛伐他汀5.0 mg/kg/d剂量灌胃。喂饲高脂饲料8周，观察GP对高脂模型大鼠血脂各成分的影响;透射电镜检测GP对高脂大鼠VSMCs超微结构的影响;免疫组化及Western blot检测GP对高脂大鼠血管平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin，SM-actin)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表达的影响。细胞水平实验:培养、鉴定人血管平滑肌细胞株(human vascular smoothmuscle cells，HVSMCs)，Real-Time PCR及Western blot检测不同浓度胆固醇(cholesterol，CH)刺激HVSMCs不同时间后SM-actin、平滑肌22α(smooth muscle22 alpha，SM22α) mRNA及蛋白表达情况;细胞增殖试剂盒、划痕实验检测CH对HVSMCs增殖、迁移的影响。透射电镜观察GP对CH诱导的HVSMCs超微结构改变的影响。Western blot检测1.0、10.0、100.0μg/mL GP处理后对HVSMCs中CH诱导的SM-actin、SM22α以及表皮调节素(Epiregulin)蛋白表达的影响;细胞增殖试剂盒、EDU试剂盒及Transwell小室检测GP处理后对CH诱导的HVSMCs活力、DNA合成及迁移情况的影响。 第二部分:体外培养HVSMCs，Western blot法检测50.0 mg/L CH对单核细胞趋化蛋白诱导蛋白(monocyte chemotactic protein-1 induced protein，MCPIP)1表达的影响。在HVSMCs中转染MCPIP1质粒，构建过表达MCPIP1的细胞模型(over expression-MCPIP1，oe-MCPIP1);用小分子干扰RNA沉默MCPIP1基因，建立沉默MCPIP1的细胞模型(si-MCPIP1)。Real-timePCR及Western blot检测MCPIP1表达，以确定过表达及沉默效率。Western blot检测在oe-MCPIP1或si-MCPIP1细胞中CH诱导的SM-actin、Epiregulin表达变化;细胞增殖试剂盒及Transwell小室分别检测在oe-MCPIP1或si-MCPIP1细胞中，CH诱导的细胞增殖、迁移情况。Real-time PCR检测在正常细胞、oe-MCPIP1或si-MCPIP1细胞中，CH作用后miR-145的表达情况。 第三部分:提取正常及高脂大鼠血管，免疫组化及Western blot法检测MCPIP1表达。Western blot检测1.0、10.0、100.0μg/mL GP对CH诱导的HVSMCs中MCPIP1表达的影响。Western blot检测GP对oe-MCPIP1或si-MCPIP1细胞中CH诱导的SM-actin、Epiregulin表达的影响。Real-time PCR检测GP对正常细胞、oe-MCPIP1或si-MCPIP1细胞中CH诱导的miR-145表达的影响。 结果: 第一部分:1.高脂模型组血TC、TG及LDL-C增高，HDL-C下降，高脂大鼠模型建立，GP或辛伐他汀处理组能降低大鼠血脂水平。2.高脂模型组VSMCs超微结构发生去分化表型改变，而GP可抑制此改变;GP能增加高脂大鼠动脉壁SM-actin蛋白表达，降低PCNA表达。3.体外成功培养、鉴定HVSMCs。不同剂量(12.5、25.0、50.0 mg/L) CH诱导HVSMCs48、72 h后可降低分化标志SM-actin、SM22α的mRAN及蛋白水平表达，促进HVSMCs增殖及迁移。4.GP可抑制CH诱导的HVSMCs去分化超微结构表型改变。10.0、100.0μg/mL GP可抑制CH诱导的SM-actin、SM22α蛋白表达的降低及Epiregulin表达增高，抑制HVSMCs的增殖及迁移。 第二部分:1.CH作用HVSMCs后，细胞内MCPIP1表达明显增高。2.MCPIP1重组质粒鉴定结果显示构建成功，转染细胞后MCPIP1蛋白表达明显增高;特异性小分子干扰RNA有效降低HVSMCs中MCPIP1 mRNA及蛋白水平，成功构建oe-MCPIP1及si-MCPIP1细胞模型。3.CH分别作用各组细胞后，与阴性对照转染组相比，oe-MCPIP1组中SM-actin的表达进一步减少、Epiregulin表达增高，细胞增殖及迁移进一步增强;而si-MCPIP1组中CH诱导的SM-actin表达减少以及Epiregulin表达增加被抑制，细胞增殖及迁移能力降低。4.CH可明显降低HVSMCs中miR-145的表达;oe-MCPIP1能增强CH降低miR-145表达的效应，使miR-145表达进一步减少;而si-MCPIP1则可减轻CH诱导的miR-145表达减少。 第三部分:1.GP可抑制高脂诱导的大鼠动脉中MCPIP1蛋白的增强;100.0μg/mLGP可减少CH诱导的HVSMCs中MCPIP1的增加。2.GP预处理后再加入CH刺激，与vector组相比，oe-MCPIP1组中SM-actin的表达下降，Epiregulin表达升高;与NS组相比，si-MCPIP1组中SM-actin的表达升高，Epiregulin表达降低。3.GP预处理可抑制HVSCMs中CH诱导的miR-145降低。4.GP预处理后，CH诱导的miR-145在oe-MCPIP1组中表达进一步降低;在siMCPIP1组中表达量升高。 结论: 1.高脂大鼠动脉平滑肌细胞发生了去分化，细胞增殖增加;GP能有效抑制高脂诱导的大鼠平滑肌细胞去分化。体外培养的HVSMCs在CH的诱导下可发生去分化，细胞增殖及迁移能力增加;GP可以有效抑制CH诱导的HVSMCs的去分化。 2.转录因子MCPIP1介导CH诱导的HVSMCs去分化;并通过抑制miR-145生成量发挥促进去分化的正调控作用。 3.MCPIP1和miR-145是GP有效抑制CH诱导的HVSMCs去分化作用的关键分子，抑制MCPIP1表达，增加细胞中miR-145表达量是GP抑制CH所致的HVSMCs去分化的重要分子机制。 4.GP抑制高脂所致的VSMCs表型去分化，是GP抗As的机理之一。