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酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一催化游离胆固醇和脂肪酸合成胆固醇酯的酶,在细胞内胆固醇代谢平衡中起非常重要的作用。目前,在哺乳动物细胞中发现两种基因编码ACAT(ACAT1和ACAT2)。ACAT1几乎在各种组织细胞中均有表达,与细胞胆固醇代谢平衡直接相关；而在肝肠细胞中特异表达的ACAT2则与外源胆固醇的吸收和脂蛋白装配等密切相关。人类动脉粥样硬化、阿尔海默氏病、胆囊结石等一些重要病变,都与ACAT密切相关。因此,ACAT已成为分子筛药的重要靶蛋白.我们实验室与美国Chang TY教授实验室的合作研究,已首先报道了两种人。ACAT基因的基因组结构和ACAT1基因的表达调控.在这些基础上,本论文进行两部分工作,第一部分重点围绕人ACAT2基因表达的可变性剪接和组织特异性进行研究,第二小部分是进行猴ACAT1 cDNA 5-UTR的克隆分析。
首先,进行可变性剪接成熟的人ACAT2 mRNAs及其编码的异构体酶活性的分析研究。人ACAT2基因长约18 kb,包含15个外显子,所有的外显子/内含子连接区序列均为经典的GT/AG序列.通过RT-PCR、克隆和DNA测序分析,获得三种人ACAT2 mRNAs.序列比较表明,它们是从同-pre-mRNA通过可变性剪接产生,外显子的缺失并未导致阅读框的改变；它们编码三种人.ACAT2产物,即ACAT2a,包含所有的15个外显子,编码522个氨基酸；ACAT2b,包含除外显子4以外的14个外显子,编码502个氨基酸；ACAT2c,包含外显子1-3、6-7、11-15,编码379个氨基酸；其中ACAT2a与文献报道完全一致,ACAT2b与ACAT2c为新发现的2个ACAl2序列.利用克隆的三种大小不同的人ACAT2ORF cDNAs构建相应的表达质粒,分别转染ACAT缺陷的AC29细胞进行表达研究,结果显示可表达出相应不同大小的ACAT2蛋白产物；同时在人肝肠细胞株中也检测到了同样不同大小的内源表达ACAT2蛋白产物。这些表明,可表达的内源性ACAT2b和ACAT2c蛋白可能是两种ACAT2异构体,而且它们的氨基酸序列特征性变化还包括缺失一个潜在的CK2(casein kinase Ⅱ)磷酸化位点SLLD,其位于外显子4编码的20个氨基酸区域内.深入进行酶活性和体外磷酸化测定结果表明,ACAT2a可被磷酸化,其异构体ACAT2b则不被磷酸化；而且异构体ACAT2b和.ACAT2c的酶活性仅为ACAT2a的25﹪～35﹪.对已报道的ACAT蛋白序列进行比较分析,发现该位点在多个物种的ACATl和ACAT2蛋白中都高度保守,提示ACAT在细胞内可通过磷酸化与非磷酸化形式调节这一多聚变构酶的活性.这些可为ACAT精细调节人细胞胆固醇代谢平衡研究提供重要的分子基础。
接着,对人ACAT2基因表达的组织特异性进行深入研究.通过构建一系列5-缺失的ACAT2基因启动子/荧光素酶报告基因质粒,分别转染分化和未分化的人结肠癌细胞Caco-2,结果显示人ACAT2基因启动子肠细胞分化依赖性的效应区位于-912～-769 bp内；计算机分析显示,该区域含有4个潜在的Cdx2和1个HNF1α元件,其中5-端的2个Cdx2元件与HNF1α元件完全重叠；凝胶阻抑实验(EMSA)结果表明转录因子Cdx2和HNF1α能特异地结合在人ACAT2基因启动子上；缺失突变、定点突变、启动子/荧光素酶报告基因活性分析和精细的EMSA结果显示ACAT2基因启动子中的Cdx2和HNF1α元件是肠细胞分化依赖启动子活性所必需；在未分化的Caco-2和NIH3T3细胞中,共转染表达的Cdx2和HNF1α能协同增强野生型人ACAT2基因启动子活性。这些实验结果证明了转录因子Cdx2和HNF1α对人ACAT2基因启动子的活性起关键作用。进一步的RT-PCR和Western blot显示,Cdx2、HNF1α和ACAT2的表达均随着Caco-2细胞分化而明显增加,并且在未分化的Caco-2细胞中共转染表达的Cdx2和HNF1α能显著提高ACAT2的表达,在分化的Caco-2细胞中通过RNAi技术抑制内源Cdx2和HNF1α表达也非常显著地降低.ACAT2的表达；这些结果表明,转录因子Cdx2和HNF1α对人ACAT2基因的肠细胞分化依赖性表达具有直接的功能作用.在研究肠组织细胞中人ACAT2基因表达的基础上,深入探索人ACAT2基因在肝组织细胞中的表达.RT-PCR实验显示,人肝细胞株、肝组织、肝癌(HCC)及癌旁组织均表达HNF1α；人正常肝细胞株LO2和肝组织中,均未观察到Cdx2和ACAT2的表达；而在肝肿瘤细胞株HepG2中,同时有Cdx2的表达,则也有ACAT2的表达；RNAi实验结果揭示在HepG2细胞中Cdx2和HNF1α表达被抑制,则可抑制ACAT2基因表达；在50﹪的HCC病人(14例中的7例)中,癌旁组织检测的结果与以上正常肝细胞株LO2、肝组织的一致,而癌组织检测的结果与以上肿瘤细胞株HepG2的一致,说明肝癌中ACAT2基因的表达与Cdx2的异位高表达密切相关,提示ACAT2可作为检验肝癌的一种新的生物标记分子。
同时,RT-PCR实验结果揭示不同人细胞株的内源Cdx2、HNF1α和ACAT2基因的表达呈现不同的模式；转录因子Cdx2和HNF1α调控 ACAT2基因的表达具有细胞特异性,LO2、HeLa和 THP-1 细胞中Cdx2和HNF1α表达增加,能促进内源ACAT2基因的表达,并且LO2和HeLa细胞中Cdx2和HNF1α对ACAT2基因的表达有协同增强效应,而在THP-1 细胞中则不体现出协同增强效应；Hep3B和HEK293细胞中Cdx2和HNF1α表达增加并不能促进内源ACAT2基因的表达增加。这些研究结果,首次详细阐明了ACAT2基因肝组织细胞特异性表达的分子机制,为深入研究人 ACAT2基因的组织细胞特异性表达调控奠定了基础。
最后,本论文还有小部分工作是对猴ACAT1 cDNA 5′-UTR的克隆分析。5′-RACE和测序结果显示,克隆的猴ACAT1 cDNA 5′-UTR也存在回文结构CCGAATTCGG序列,提示该序列也可能来源于两条染色体.这些研究将为ACAT1在pre-mRNA水平上的调控研究提供一定的基础。
综上所述,在本论文的上述两部分工作中,发现人ACAT2基因表达存在可变性剪接,发现2个新的人ACAT2异构体 ACAT2b和 ACAT2c、鉴定了一个在ACAT1、ACAT2中均保守的、可磷酸化的位点；发现转录因子Cdx2、HNF1α
协同增强人ACAT2基因启动子的转录活性,首次揭示了人ACAT2基因的肠细胞分化依赖性和组织特异性表达的分子机制；发现肠细胞特异转录因子Cdx2的异位表达引起人肝癌组织表达ACAT2,为肝癌早期诊断提供潜在的新生物标记分子；发现克隆的猴ACAT1 cDNA 5′-UTR也存在回文结构CCGAATTCGG序列,提示该序列也可能来源于两条染色体。这些为深入研究阐明ACAT基因表达的调控及其在胆固醇代谢平衡中的生理功能和病理作用等提供了重要基础和研究线索。
表达；Caco-2；HCC:猴ACAT1 cDNA 5′-UTR酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)催化游离胆固醇和脂肪酸合成胆固醇酯,其在动脉粥样硬化和.Alzheimer病变过程中都起着十分重要的作用.目前已发现,在哺乳动物中存在两种形式的ACAT,其中广泛分布于各种组织细胞的ACATl主要参与胆固醇代谢平衡,而在肝肠细胞中特异表达的ACAT2则与外源胆固醇的吸收和脂蛋白装配密切相关.本工作是在我们揭示人ACAT2基因组织结构的基础上,深入研究ACAT2基因表达的可变性剪接.人ACAT2基因长约18 kb,包含15个外显子,所有的外显子/内含子连接区序列均为经典的GT/AG序列.通过RT-PCR、克隆和序列分析,获得三种人ACAT2 mRNAs.序列比较表明,它们是从同-pre-mRNA通过可变性剪接产生,外显子的缺失并未导致阅读框的改变；它们编码三种人ACAT2产物,即ACAT2a,包含所有的15个外显子,编码522个氨基酸；ACAT2b,包含除外显子4以外的14个外显子,编码502个氨基酸；ACAT2c,包含外显子1-3、6-7、11-15,编码379个氨基酸；其中ACAT2a与文献报道完全一致,ACAT2b与ACAT2c为发现的新ACAT2序列。利用三种大小不同的人ACAT2 ORF cDNAs构建相应的表达质粒,分别转染ACAT缺陷的AC29细胞进行表达研究,结果显示可表达出相应大小的ACAT2蛋白产物；同时在人肝肠细胞株中也检测到了同样的内源表达ACAT2蛋白产物。