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前言14-3-3σ是14-3-3蛋白家族中的一员,14-3-3σ直接参与人类肿瘤的发生、发展,在多种人类恶性肿瘤中常有其蛋白或基因表达异常。hASH1基因是human achaete-scute homologue 1的简称,是bHLH(basic helix-loop-helix)基因家族成员之一,bHLH蛋白构成多个转录因子家族,这些转录因子参与胚胎的发育和肿瘤的形成。研究表明在肺神经内分泌癌中14-3-3σ表达明显减少。然而hASH1在肺神经内分泌肿瘤高表达,而在非神经内分泌肿瘤不表达或低表达。14-3-3σ蛋白参与细胞周期G2期检测点,它的缺失会引起的G2期检测点缺陷,使细胞过早进入有丝分裂而导致肿瘤发生。14-3-3σ基因在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、皮肤癌和肝癌等多种类型肿瘤中因其启动子CpG甲基化而沉默或低表达。研究证实在神经内分泌肿瘤中同样存在14-3-3σ基因启动子高度的超甲基化从而引起其低表达,并且14-3-3σ表达下降对神经内分泌肿瘤形成可能是必需的。研究发现给予甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-Aza)或组蛋白脱乙酰基酶抑制剂便可逆转14-3-3σ的超甲基化。而hASH1是一种组蛋白甲基转移酶,可以使组蛋白去乙酰化和H3组蛋白4,9,20,27,36位赖氨酸甲基化,从而使基因沉默。同时Osada.H等研究发现：用RNAi方法抑制肺癌细胞系中的hASHl表达,可以引起该肿瘤细胞在G2-M期细胞周期停滞和细胞凋亡,从而达到治疗的目的,但是其分子机制不清。本研究旨在探讨在肺神经内分泌肿瘤中是否存在hASH1通过其甲基转移酶的作用使14-3-3σ启动子超甲基化,引起14-3-3σ沉默或低表达,造成G2-M期检测点缺失,细胞发生恶性转化,从而产生肿瘤,以及14-3-3σ表达与肺腺癌临床病理参数关系。材料与方法一、材料47例新鲜肺腺癌标本(来自中国医科大学附属一院2008.5-2009.7),其中男性患者16例,女性患者31例；年龄34—73岁(平均52.5±10)；淋巴结转移阳性者23例,淋巴结转移阴性者24例；Ⅰ+Ⅱ共19例,Ⅲ+Ⅳ共28例(国际抗癌联盟2003年分期标准)。五种细胞系：肺巨细胞癌细胞系BE-1；肺大细胞癌细胞系NCI-H460;肺腺癌细胞系LTEP-α-1,A549；肺小细胞癌细胞系NCI-H446。二、主要试剂和来源浓缩型羊抗人14-3-3σ蛋白多克隆抗体(SC-7683,Santa Cruz),浓缩型兔抗人hAshl蛋白多克隆抗体(ab-38557,abCam),Easy RT-PCR Kit(AE401,北京全式金公司),TRIzol Reagent (15595-026, invitrogen) hAsh1引物,14-3-3σ引物,β-actin引物三、方法(一)RT-PCR取组织和对数生长期的细胞用TRIzol (invitrogen)提取总RNA,逆转录条件为30℃10min,42℃40min,99℃5min,5℃5min。PCR反应条件为：94℃5min,94℃30sec,55℃30sec,72℃40sec,72℃10min。取扩增产物5ul,2%琼脂糖凝胶电泳,用Image J软件进行表达强度分析。(二)Western Blot取对数生长期的细胞提取总蛋白,超声破碎2下,15000rpm离心15min,取上清约60u1,5%浓缩胶,15%分离胶电泳,电压浓缩胶60V,分离胶100V。40V电压转印约90min。在TBS/0.3%Tween-20/5%小牛血清中封闭2h。14-3-3σ和hASHl均一抗(1：500)4℃孵育过夜,二抗(1：5000)37℃孵育2h。中心实验室发光检测。以上实验相同条件重复3次。四、统计学分析采用SPSS13.0统计学分析软件,对14-3-3σ、hASH1的表达与临床病理因素的关系用X2检验；14-3-3σ和hASH1表达关系采用Spearman等级相关分析,其它采用t检验；P<0.05为有统计学意义。结果一、不同肺癌细胞系中14-3-3σ、hASHl的表达情况及两者关系(一)RT-PCR结果在五种肺癌细胞系中14-3-3σmRNA有不同程度的表达,其中小细胞癌细胞系446最高,其次是腺癌细胞系LTE和A549(正常肺组织不表达14-3-3σ)。hASH1在具有神经内分泌特征的肺小细胞癌细胞系446和肺大细胞癌细胞系460中高表达。但从mRNA水平来看两者之间似乎缺乏相关性(二)Western Blot结果在五种肺癌细胞系中14-3-3σ蛋白有不同程度的表达,其中小细胞癌细胞系446最高,其次是腺癌细胞系LTE和A549(正常肺组织不表达14-3-3σ)。hASH1在具有神经内分泌特征的肺小细胞癌细胞系446和肺大细胞癌细胞系460中高表达。以上结果与RT-PCR结果基本一致。从蛋白水平来看两者之间同样缺乏相关性二、肺腺癌中14-3-3σ表达高低与肺腺癌的分化、临床病理分期和淋巴结转移相关通过RT-PCR方法检测了47例肺腺癌切除标本和癌旁组织,结果显示14-3-3σmRNA在癌组织表达明显高于对应的正常肺组织,进一步结合临床病理参数统计发现14-3-3σmRNA在低分化的肺腺癌中表达明显高于高分化肺腺癌,即与肺腺癌的分化程度呈负相关。14-3-3σmRNA高表达患者与低表达患者相比进展更快(P=0.001),更容易发生淋巴结转移相关(P=0.004),而与患者年龄(P=0.496)和性别(P=0.765)无关。这些结果表明14-3-3σ可能参与了肺腺癌的分化、演进及淋巴结转移。结论14-3-3σ可能与肺腺癌的发生、发展、分化程度、临床病理分期和淋巴结转移有关。并且从总体上看在5种肺癌细胞系中14-3-3σ和hASH1两者表达之间缺乏明确的负相关性。