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本文利用功能化DNA(核酸适体和DNA酶)的特性,结合纳米材料或者信号扩增技术,设计面向重金属离子环境物、疾病相关基因突变DNA和MicroRNA检测的传感器。
(1)核酸适体和氧化石墨烯相结合的检测传感平台
利用体外筛选的金属汞离子和银离子的核酸适体(称为汞离子特异性DNA和银离子特异性DNA),结合纳米材料石墨烯对单双链DNA结合能力的差异,设计了针对重金属汞离子和银离子的荧光传感策略。荧光修饰的核酸适体在结合目标金属离子后,会发生构象显著变化,进而导致和纳米材料石墨烯的相互作用发生变化,最终引起荧光差异,实现特异检测靶分子的检测。基于这个原理,本平台实现了对Hg2+离子和Ag+离子快速、高灵敏、特异的检测。对Ag+的检测浓度达到20 nM,远低于美国环境保护机构对饮用水含银离子上限。同时这个策略也可以应用于实际样品检测。
(2)基于金属调节的核酶和氧化石墨烯相互作用的传感策略
通过调节金属依赖的核酶的活性调节其和氧化石墨烯之间的相互作用。核酶是金属依赖的具有催化活性的DNA,在金属的调节下自催化切割,切割后导致构象变化,这种变化被氧化石墨烯识别,引出信号转化。根据这一原理,我们设计了铅离子检测传感器,在铅离子存在的条件下,核酶有了活性,对自身进行切割,导致由双链变成单链而被氧化石墨烯吸附,其末端修饰的荧光被淬灭,这一变化被荧光分光光度计读出。这个传感策略实现对pb2+的特异检测,其检测限达到0.5μM,检测范围为0.5μM-2μM,在放大检测范围的策略下,能达到1μM-100μM的检测范围。同时这个策略也可以应用于实际样品梯度检测。
(3)基于核酸滚环扩增和切刻酶信号分子扩增技术联用的传感策略G-四联体结构DNA结合亚铁血红素后,具有类辣根过氧化物酶活性(DNAzyme)。利用DNAzyme做为信号放大原件,结合滚环扩增放大核酸分子数量和限制性切刻酶放大信号方式联用,实现了对DNA和miRNA的灵敏检测。具体设计为,一个DNA和miRNA目标分子首先通过滚环扩增放大为几千到几万碱基的单链重复片断,切刻酶信号扩增技术再对这些扩增出的这些分子再次放大,两个放大作用的联合,释放了信号分子DNAzyme,最后通过DNAzyme催化的氧化还原双氧水,使ABTS形成自由基阳离子ABTS+实现显色检测。这一策略的优势是不需要复杂的RT-PCR过程,可在常温下进行,实现aM级的DNA或miRNA灵敏检测。我们将此策略应用于实际样品体系进行评估,在果蝇体液这种复杂检测体系中能检测到数十个miRNA分子。