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目的:创伤、退行性病变或肿瘤等原因导致的骨缺损仍然是骨骼修复重建的主要难题。同种异体骨移植和自体骨移植是当前治疗骨缺损的最佳手段。而这两种治疗都有其局限性,如供体组织有限、供体部位发病率高、手术复杂、同种异体移植物疾病传播或免疫排斥的可能性、且移植物无法准确塑形替代原组织的生物力学特性。如何实现骨缺损修复重建一直是当今医学界的难题,组织工程支架为解决这一难题提供了很好的思路。本实验旨在采用冷冻干燥法制备胶原蛋白/壳聚糖/羟基磷灰石三维仿生骨组织工程支架,并观察胶原蛋白/壳聚糖/羟基磷灰石三维复合支架对骨髓间充质干细胞的增殖和分化的影响。目的是研究组织工程支架治疗骨缺损修复重建的可行性。方法:1.大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养和分化鉴定:抽取清洁级健康雄性SD大鼠骨髓,密度梯度离心法提取单个核细胞,贴壁法分离骨髓间充质干细胞。通过CCK-8法检测细胞生长曲线;成骨诱导分化培养后,进行茜素红染色检测矿物结节染色评估成骨分化情况。2.胶原/壳聚糖/羟基磷灰石复合支架制备:采用冷冻干燥法制备胶原蛋白/壳聚糖/羟基磷灰石三维仿生骨组织工程支架。通过肉眼观察复合支架的大体形态、扫描电镜下观察其内部结构及复合材料表观特征记录支架外部形态特点;采用液体置换法测定支架孔隙率、体外模拟液中检测支架降解率及降解液pH值、使用Instron5865力学试验机测试支架力学性能。3.复合支架对骨髓间充质干细胞黏附、増殖、迂移及分化的影晌:利用BMSCs作为种子细胞,以胶原/壳聚糖/羟基磷灰石复合支架作为载体进行支架细胞共培养。用激光全息细胞分析及成像系统检测复合支架上细胞黏附率;使用倒置显微镜及扫描电镜观察复合支架上细胞的生长情况;CCK-8法检测复合培养后的细胞活性;采用qRT-PCR法检测细胞接种后第2W时成骨相关基因骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、及I型胶原(COL-I)的表达情况。结果:1.经雄性SD大鼠骨髓腔分离提取得到骨髓间充质干细胞浓度较大,倒置显微镜下观察见细胞呈圆形,胞浆丰满,大小不均,生长良好。随着时间推移,细胞数量不断增加,且绝大多数细胞呈长梭形;CCK-8法检测骨髓间充质干细胞的生长曲线,整体呈现出“S”形趋势,较好地反映出了骨髓间充质干细胞的生长周期特点;骨髓间充质干细胞成骨诱导培养2W后,茜素红染色及碱性磷酸酶染色阳性,表明骨髓间充质干细胞己经向成骨细胞表型分化并分泌基质。2.大体观察可见支架表面较光滑,表面可见孔隙分布均匀,具有三维多孔连通结构;扫描电镜观察显示支架内部有多孔径立体结构,平均直径为200-250μm,孔壁厚度在6μm,此种孔径较为适宜骨髓间充质干细胞的迁移和营养物质的传输。此外,材料表面还具有层叠形状孔道,有利于种子细胞的黏附与伸展;架孔隙率为(71.1±2.2)%,第8周降解率为(26.3±1.8)%,支架降解液pH波动在6.5-7.5之间;机械性能检测结果证实,支架质地坚韧,浸泡入PBS后稍变软,形态具有可复性和延展性,其弹性模量为(26.14892±6.53726)MPa。3.通过激光全息细胞分析及成像系统测试发现支架材料上NSCs的黏附率随着培养时间延长呈增加趋势,并于种植24h后达(85.3±10.1)%;倒置显微镜下观察可见BMSCs呈“放气球样”贴附于支架表面,扫描电镜观察显示支架孔径互相交错、呈多层立体结构,可见支架表面吸附较多BMSCs,呈串珠状,还可见细胞蟠曲围绕于支架内部孔隙;CCK-8检测结果证实胶原/壳聚糖/羟基磷灰石三维复合支架材料无毒性,且能适当促进BMSCs生长、增殖。诱导培养7d、14d后,支架细胞共培养组的骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、及I型胶原(COL-I)表达水平均高于基础培养基组,两组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:1.本次实验采用全骨髓贴壁培养法可成功分离培养生物活性强、纯化度高、具多向分化潜能的SD大鼠BMSCs。该方法简单易行、无特殊条件要求。2.采用低温冷冻干燥技术可成功制备胶原/壳聚糖/羟基磷灰石复合支架,支架孔径互相交错、呈多层立体结构,较高比表面积、密集微孔隙度、力学性能良好。3.胶原蛋白/壳聚糖/羟基磷灰石三维复合支架具有良好的生物相容性,且能促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,具有良好的应用前景。