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【目的】
探讨阿维A治疗转谷氨酰胺酶1（TGM1）基因突变的板层状鱼鳞病的分子机制，为板层状鱼鳞病发病机制的探讨和防治提供新的理论依据。
【方法】
采用瞬时转染2个TGM1突变体质粒（Mut1和Mut3）和建立Mut1、Mut3稳定表达HaCaT细胞株方法，观察TGM1（Mut1和Mut3）在HaCaT细胞mRNA和蛋白水平过表达情况以及对HaCaT细胞增殖及细胞周期的影响；MTS和流式细胞技术检测TGM1干扰质粒（sh-543）瞬时转染HaCaT细胞后对HaCaT细胞增殖和细胞周期的影响；MTS和流式细胞技术检测阿维A对Mut1、Mut3稳定表达HaCaT细胞株和HaCaT细胞的增殖抑制率和细胞周期影响；qRT-PCR和WesternBloting检测阿维A对Mut1、Mut3稳定表达HaCaT细胞株和HaCaT细胞TGM1mRNA和蛋白表达水平影响；利用荧光素酶报告基因检测阿维A对TGM1（-2133/+297）基因启动子与TGM3(-1966/+34)基因启动子活性；qRT-PCR检测阿维A对TGM3基因mRNA水平表达的影响。
【结果】
1.Mut1和Mut3突变体质粒瞬时转染HaCaT细胞后，在HaCaT细胞中TGM1的mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组；sh-543干扰质粒瞬时转染HaCaT细胞后可明显下调TGM1mRNA和蛋白表达水平。
2.Mut1和Mut3突变体质粒瞬转HaCaT细胞后，对HaCaT细胞增殖均有不同程度的时间依赖性抑制，但只有Mut1瞬转72h后对HaCaT细胞增殖有显著的抑制（P＜0.01）；sh-543干扰质粒瞬转HaCaT细胞48h和72h后对HaCaT细胞增殖均有显著的抑制（P＜0.05和P＜0.01）。
3.Mut1和Mut3突变体质粒瞬转HaCaT细胞72h后，Mut1瞬转HaCaT细胞G1期明显增加（P＜0.05），S期显著减少（P＜0.01）；Mut3瞬转HaCaT细胞G2/M期明显增加（P＜0.01）；sh-543干扰质粒瞬转HaCaT细胞72h后，sh-543瞬转HaCaT细胞G1期明显增加（P＜0.05），S期显著减少（P＜0.01）。
4.Mut1和Mut3稳定表达的HaCaT细胞株TGM1mRNA均显著高于对照组（8.65±0.44vs0.98±0.03；9.19±0.22vs0.99±0.04；均P＜0.001）。
5.Mut1和Mut3稳定表达HaCaT细胞株细胞增殖均受到不同程度的时间依赖性抑制，48h和72h对HaCaT细胞增殖均有显著的抑制（P＜0.01或/和P＜0.001）。
6.Mut1与Mut3稳定表达HaCaT细胞株培养72h后，Mut1稳定表达HaCaT细胞株细胞G1期明显增加（P＜0.05），S期显著减少（P＜0.05）；Mut3稳定表达HaCaT细胞株细胞G1期明显增加（P＜0.01），S期显著减少（P＜0.01）。
7.50μM阿维A处理Mut1与Mut3稳定表达HaCaT细胞株和HaCaT细胞72h后，细胞增殖抑制率均约为10%。50μM阿维A处理的HaCaT细胞和无阿维A处理的HaCaT细胞的G1、S和G2/M比较，无明显差异（P＞0.05）。
8.50μM阿维A处理的Mut1与Mut3稳定表达HaCaT细胞株和HaCaT细胞TGM1mRNA和蛋白表达水平明显低于无阿维A处理的对照细胞（均P＜0.05）。
9.50μM阿维A处理的Mut1稳定表达HaCaT细胞株和无阿维A处理的Mut1稳定表达HaCaT细胞株比较，G1期明显减少（P＜0.01），S和G2/M期显著增加（P＜0.05）。同样，50μM阿维A处理的稳定表达HaCaT细胞株和无阿维A处理的Mut3稳定表达HaCaT细胞株比较，G1期明显减少（P＜0.01），S和G2/M期显著增加（P＜0.05）。
10.50μM阿维A处理HaCaT细胞后，TGM1（-2133/+297）启动子活性显著降低（P＜0.001），而TGM3(-1966/+34)基因启动子活性显著增加（P＜0.001）。
11.50μM阿维A处理Mut1与Mut3稳定表达HaCaT细胞株和HaCaT细胞后TGM3mRNA表达水平明显高于无阿维A处理的对照细胞（P＜0.05）。
【结论】
1.TGM1（Mut1和Mut3）突变通过增加G1期，减少S期对HaCaT细胞增殖均有不同程度的抑制作用。
2.在TGM1突变的LI中，阿维A可能通过抑制TGM1的表达，上调TGM3的表达，使细胞周期中G1期减少，S和G2/M期增加来调节角质形成细胞的增殖。
探讨阿维A治疗转谷氨酰胺酶1（TGM1）基因突变的板层状鱼鳞病的分子机制，为板层状鱼鳞病发病机制的探讨和防治提供新的理论依据。
【方法】
采用瞬时转染2个TGM1突变体质粒（Mut1和Mut3）和建立Mut1、Mut3稳定表达HaCaT细胞株方法，观察TGM1（Mut1和Mut3）在HaCaT细胞mRNA和蛋白水平过表达情况以及对HaCaT细胞增殖及细胞周期的影响；MTS和流式细胞技术检测TGM1干扰质粒（sh-543）瞬时转染HaCaT细胞后对HaCaT细胞增殖和细胞周期的影响；MTS和流式细胞技术检测阿维A对Mut1、Mut3稳定表达HaCaT细胞株和HaCaT细胞的增殖抑制率和细胞周期影响；qRT-PCR和WesternBloting检测阿维A对Mut1、Mut3稳定表达HaCaT细胞株和HaCaT细胞TGM1mRNA和蛋白表达水平影响；利用荧光素酶报告基因检测阿维A对TGM1（-2133/+297）基因启动子与TGM3(-1966/+34)基因启动子活性；qRT-PCR检测阿维A对TGM3基因mRNA水平表达的影响。
【结果】
1.Mut1和Mut3突变体质粒瞬时转染HaCaT细胞后，在HaCaT细胞中TGM1的mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组；sh-543干扰质粒瞬时转染HaCaT细胞后可明显下调TGM1mRNA和蛋白表达水平。
2.Mut1和Mut3突变体质粒瞬转HaCaT细胞后，对HaCaT细胞增殖均有不同程度的时间依赖性抑制，但只有Mut1瞬转72h后对HaCaT细胞增殖有显著的抑制（P＜0.01）；sh-543干扰质粒瞬转HaCaT细胞48h和72h后对HaCaT细胞增殖均有显著的抑制（P＜0.05和P＜0.01）。
3.Mut1和Mut3突变体质粒瞬转HaCaT细胞72h后，Mut1瞬转HaCaT细胞G1期明显增加（P＜0.05），S期显著减少（P＜0.01）；Mut3瞬转HaCaT细胞G2/M期明显增加（P＜0.01）；sh-543干扰质粒瞬转HaCaT细胞72h后，sh-543瞬转HaCaT细胞G1期明显增加（P＜0.05），S期显著减少（P＜0.01）。
4.Mut1和Mut3稳定表达的HaCaT细胞株TGM1mRNA均显著高于对照组（8.65±0.44vs0.98±0.03；9.19±0.22vs0.99±0.04；均P＜0.001）。
5.Mut1和Mut3稳定表达HaCaT细胞株细胞增殖均受到不同程度的时间依赖性抑制，48h和72h对HaCaT细胞增殖均有显著的抑制（P＜0.01或/和P＜0.001）。
6.Mut1与Mut3稳定表达HaCaT细胞株培养72h后，Mut1稳定表达HaCaT细胞株细胞G1期明显增加（P＜0.05），S期显著减少（P＜0.05）；Mut3稳定表达HaCaT细胞株细胞G1期明显增加（P＜0.01），S期显著减少（P＜0.01）。
7.50μM阿维A处理Mut1与Mut3稳定表达HaCaT细胞株和HaCaT细胞72h后，细胞增殖抑制率均约为10%。50μM阿维A处理的HaCaT细胞和无阿维A处理的HaCaT细胞的G1、S和G2/M比较，无明显差异（P＞0.05）。
8.50μM阿维A处理的Mut1与Mut3稳定表达HaCaT细胞株和HaCaT细胞TGM1mRNA和蛋白表达水平明显低于无阿维A处理的对照细胞（均P＜0.05）。
9.50μM阿维A处理的Mut1稳定表达HaCaT细胞株和无阿维A处理的Mut1稳定表达HaCaT细胞株比较，G1期明显减少（P＜0.01），S和G2/M期显著增加（P＜0.05）。同样，50μM阿维A处理的稳定表达HaCaT细胞株和无阿维A处理的Mut3稳定表达HaCaT细胞株比较，G1期明显减少（P＜0.01），S和G2/M期显著增加（P＜0.05）。
10.50μM阿维A处理HaCaT细胞后，TGM1（-2133/+297）启动子活性显著降低（P＜0.001），而TGM3(-1966/+34)基因启动子活性显著增加（P＜0.001）。
11.50μM阿维A处理Mut1与Mut3稳定表达HaCaT细胞株和HaCaT细胞后TGM3mRNA表达水平明显高于无阿维A处理的对照细胞（P＜0.05）。
【结论】
1.TGM1（Mut1和Mut3）突变通过增加G1期，减少S期对HaCaT细胞增殖均有不同程度的抑制作用。
2.在TGM1突变的LI中，阿维A可能通过抑制TGM1的表达，上调TGM3的表达，使细胞周期中G1期减少，S和G2/M期增加来调节角质形成细胞的增殖。