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丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)属于黄病毒科，是有包膜的单股正链RNA病毒，其基因组长9.6kb，根据序列同源性至少可划分为6个基因型以及很多的亚型和分离株。基因型之间不仅存在序列差异，而且对抗病毒治疗的应答也不同。基因型1b和2a是中国丙型肝炎患者中最常见的基因型。 HCV的体外培养模型对研究HCV生命周期及抗病毒药物开发非常重要。由于患者血清不能感染Huh7来源细胞系，体外培养HCV必须得制备感染性cDNA克隆。基于JFH-1或嵌合体J6/JFH-1的真病毒细胞感染模型于2005年构建成功，随后来源于其它基因型的5UTR-NS2、NS3/NS4A或NS5A与JFH-1的嵌合病毒也相继被报道。最近，通过对共有序列的克隆引入适应性突变，科学家们已经建立了1a型的TN株、2a型的JFH-2和J6、2b型的J8、DH8和DH10株的高效感染性克隆。这些研究几乎全部是基于实验室已优化过的原型株，而直接来自于临床病毒株的全长或者嵌合HCV细胞培养模型鲜有报道。 在第一部分的工作中，为了研究从临床病毒株直接构建重组HCV病毒的可能性，我们选择了三例中国基因型1b丙型肝炎患者血清样品，从中扩增了从Core到NS2的第一个跨膜结构域，与JFH-1的基因组融合后，通过克隆筛选策略，我们一共得到4个克隆，能在Huh7.5.1细胞中产生感染性病毒。长期传代得到的病毒在1b基因型来源的区域发生的适应性突变能有效增加病毒感染力。以E2蛋白的单克隆抗体及原始患者血清对上述病毒做中和实验，发现其中三株病毒(26C3mt，52B6mt和79L9)可以被有效中和，而26C6mt对中和抗体几无反应。这些临床来源的病毒不仅可以在毒株特异性的水平上用于研究Core-NS2的功能，筛选中和抗体，而且对我们理解病毒的组装与释放等各方面都很有帮助。 在第二部分的工作中，我们将克隆筛选策略扩展到HCV的全基因组，通过对一例基因型2a患者血清(PR63)体外培养中有功能片段的组合及在细胞内的适应，构建了来源于中国丙型肝炎患者血清的第一个全长感染性cDNA克隆。我们首先逐段筛选并验证了PR63来源的Core-NS3、NS3-NS5A及NS5B片段在JFH-1骨架上可以有效地进行体外培养并产生病毒，然后通过对有功能片段的组合及进一步筛选、优化，得到了全长的PR63感染性克隆PR63cc。PR63cc可以在Huh7来源的肝细胞系中高效扩增，最高感染性滴度可达1.6×105ffu/mL;PR63cc可以被E2抗体中和，也可以被我们所测试的几个抗病毒药物抑制;与JFH-1相比，PR63cc对NS5A的抑制剂Daclatasvir高度不敏感。我们开发的这种构建HCV全长感染性克隆的方法，不仅能应用于其他临床分离株，还可能为今后丙型肝炎患者的个性化治疗带来便利。