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BMPs(BMP)属于转化生长因子(TGF)-β超家族，BMPs最早是从骨中提取得到，能够在体内诱导异位骨和软骨形成，迄今为止，已经有40多个BMPs基因相继被克隆。许多BMPs的体外(in vitro)和体内(in vivo)实验表明BMPs具有调节成骨细胞和成软骨细胞的分化，诱导异位骨形成，促进骨折愈合，及具有控制哺乳动物骨骼不同形态特征形成的功能。BMP-2是BMP家族中的重要一员，其高效的诱导成骨活性已经在临床前以及临床实验中得到证实，显示了在治疗难愈性骨折治疗，骨质疏松症的预防，脊柱融合术，牙齿工程等众多临床应用中的巨大潜力。
本研究采用基因工程的方法，在体外表达重组人骨形态发生蛋白2。研究中采用RT-PCR、cDNA克隆、真核表达载体构建、细胞转染，稳定表达细胞系的克隆、Western Blot等生物学技术与方法，在哺乳动物细胞中表达rhBMP-2蛋白，筛选稳定、高效表达rhBMP-2的重组CHO细胞系。现将已完成的工作报告如下：
1、rhBMP-2真核表达载体的构建。以本实验室已构建的含有hBMP-2 cDNA全长序列(GenBank accessionNo.NM-001200)的质粒pCDNA6A-hBMP-2为模板，通过PCR反应扩增得到hBMP-2的cDNA全长序列，并将其连接至表达载体质粒pCDNA3.1(+)中，构建了hBMP-2的真核表达质粒pCDNA3.1(+)-hBMP-2，用其转化感受态细胞E.coli DH5α，采用菌落PCR的方法筛选阳性菌落，并进一步提取质粒DNA进行酶切鉴定，鉴定结果与预期吻合，测序结果表明读码框完全正确。
2、构建稳定、高效表达rhBMP-2的CHO细胞系。将真核表达载体pCDNA3.1(+)-hBMP2与筛选标记载体pSV2-dhfr以1:5(摩尔比)混合，利用脂质体法共转染CHO(dhfr-)细胞。G418及dhfr+双抗性筛选3周后，获得稳定转染hBMP2和空载的细胞系，利用MTX扩增系统大量扩增hBMP-2基因在宿主染色体上的拷贝数，借以大幅度提高重组CHO细胞rhBMP-2的表达水平，最终获得了高效表达rhBMP-2稳定转染细胞系。分别命名为rCHO(AhBMP-2)和rCHO(△ C)。RT-PCR和Western Blot鉴定结果显示：rCHO(△ hBMP-2)细胞表达hBMP-2 mRNA和合成rhBMP-2蛋白。
3、rhBMP-2表达量检测及体外活性分析。用单细胞分离培养的方法分离培养取得rCHO(△hBMP-2)的单克隆细胞株，以ELISA法检测各单克隆细胞株的rhBMP-2的表达量，最终筛选出稳定高效表达rhBMP-2的rCHO(△hBMP-2)的单克隆细胞株。鼠成肌细胞系C2C12在hBMP-2的刺激培养下，能够改变分化方向，由成肌分化转变成成骨分化，而碱性磷酸酶是成骨细胞的标志酶。收集得到rCHO(△hBMP-2)的细胞培养液，制成不同浓度的条件培养基刺激培养C2C12细胞，通过测定碱性磷酸酶(ALP)的活性变化来分析rhBMP-2的生物学活性。
综上所述，成功构建了hBMP-2的真核表达载体pCDNA3.1(+)-hBMP-2，将其与质粒pSV2-dhfr共转染CHO(dhfr-)细胞，利用MTX扩增系统提高重组CHO细胞rhBMP-2的表达水平，单细胞分离培养及ELISA法检测rhBMP-2蛋白的表达量，最终获得了稳定表达rhBMP-2的重组细胞rCHO(△hBMP-2)的高表达单克隆细胞株，活性分析表明，rhBMP-2具有很强的生物学活性，为进一步工程化生产rhBMP-2提供了前期基础。