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1.目的:通过制作雄性清洁级健康斯普拉格-道利大鼠(SD大鼠)肾脏缺血再灌注损伤模型,分析富含氢气的生理盐水(HRS)对大鼠肾脏缺血再灌注损伤时表达P38MAPK的影响,揭示富含氢气的生理盐水(HRS)对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用机制。2.方法:选用24只3月龄大的清洁级斯普拉格-道利大鼠(SD大鼠)进行动物实验,重220至250克,由苏州大学动物实验中心提供,符合国家二级实验动物标准。在恒定室温22-25℃,12:12小时日夜周期循环,不限量进食和喝水的情况下饲养实验大鼠。随机分为4组,每组各6只,即:正常对照假手术组(Sham Operation group,SO组,n=6)、常规的生理盐水组(NS组,n=6)、富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组,n=6)和富含氢气的生理盐水bid组(HRSbid组,n=6),实验动物造模前3天,常规的生理盐水对照组(NS组)、富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)和富含氢气的生理盐水bid组(HRSbid组),分别灌胃常规的生理盐水5ml/Kg*d、富含氢气的生理盐水5ml/Kg*d qd、bid,持续3天。正常对照假手术组(SO组)游离左侧肾蒂+右侧肾脏切除,游离并显露左侧肾脏1h,未造成缺血再灌注损伤;缝合腹壁后24小时采集大鼠下腔静脉血+获取其左侧肾脏标本。常规的生理盐水组(NS组)、富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)和富含氢气的生理盐水bid组(HRSbid组),给予其右侧肾脏切除+无损伤动脉夹夹闭左侧肾蒂1h进行缺血造模,然后再开放无损伤动脉夹进行再灌注24小时(既往文献研究提示肾脏缺血再灌注损伤24H为研究其急性损伤的最佳时间点),肾脏由暗红色变为鲜红色表示再灌注造模成功;并采集下腔静脉血+获取其左侧肾脏标本。肌酐(Scr)、尿素氮(BUN),了解其肾脏功能情况;测定血清丙二醛(MDA)值,了解肾脏受损程度,测定血清超氧化物歧化物酶(SOD)值,明确富含氢气的生理盐水对肾脏损伤有无保护性作用;肾脏组织病理学检查,常规采用H-E染色,后在高倍光镜下观察其病理改变;采用TUNNEL法检测肾脏肾小管细胞的凋亡情况,应用免疫组化法观察促分裂素原活化蛋白激酶(P38MAPK)、磷酸化的促分裂素原活化蛋白激酶(P-P38MAPK)染色情况,以期明确不同预处理后的肾脏缺血再灌注损伤中的表达情况,以便证实富含氢气的生理盐水对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用。本实验数据均采用SPSS17.0统计软件分析处理,算术均数±标准差表示本实验所得的数据,采用方差分析,q检验分析两两组间数据。两两比较有统计学意义,即P<0.05。3结果:3.1肾脏组织损伤情况:肾脏缺血1H再灌注24H后组织学评分分别为:正常对照假手术组(SO组):2.82±1.25、富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组):4.51±0.46、常规的生理盐水组(NS组):25.36±5.02,组间两两比较差异显著(P<0.05);而正常对照假手术组(SO组)、富含氢气的生理盐水bid组(HRSbid组)(5.18±1.01)及常规的生理盐水组(NS组)之间,组间两两比较差异显著(P<0.01);此外,富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)与富含氢气的生理盐水bid(HRSbid组)之间比较不存在统计学差异(P>0.05)。3.2肾脏功能情况:各组间血清肌酐水平(μmol/L)分别为:正常对照假手术组(SO组)(33.25±8.25)、富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)(47.6±10.01)、常规的生理盐水组(NS组)(80.4±10.22),组间两两比较差异显著(P<0.05);而正常对照假手术组(SO组)、富含氢气的生理盐水bid组(HRSbid组)(50.4±7.27)及常规的生理盐水组(NS组)之间,组间两两比较亦差异显著(P<0.01),此外富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)与bid(HRSbid组)之间血清肌酐水平比较不存在统计学差异(P>0.05);各组间血清BUN水平(mmol/L)分别为:正常对照假手术组(SO组)(5.92±0.21)、富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)(17.07±2.14)、常规的生理盐水组(NS组)(30.13±4.26),组间两两比较差异显著(P<0.05);而正常对照假手术组(SO组)、富含氢气的生理盐水bid组(HRSbid组)(15.82±7.66)及常规的生理盐水组(NS组)之间,组间两两比较亦差异显著(P<0.01),此外富含氢气的生理盐水qd(HSqd组)组与bid(HSbid组)之间血清BUN水平比较不存在统计学差异(P>0.05)。3.3肾脏组织氧化应激反应性改变情况:各组间血清SOD水平(μmol/(g.prot))分别为:正常对照假手术组(SO组)(40.5±6)、富含氢气的生理盐水qd组(HSqd组)(54.2±12.1)、常规的生理盐水组(NS组)(90.2±12.8),组间两两比较差异显著(P<0.05);而正常对照假手术组(SO组)、富含氢气的生理盐水bid组(HRSqd组)(55±10.5)及常规的生理盐水组(NS组)之间,组间两两比较亦差异显著(P<0.05),此外富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)与bid(HRSbid组)之间血清SOD水平比较不存在统计学差异(P>0.05);富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)和bid组(HRSbid组)大鼠血清MDA值分别为5.84±0.81nmol/ml、6.02±0.13nmol/ml,与常规的生理盐水组(NS组)(8.11±1.25nmol/ml)及正常假手术对照组(SO组)(3.04±0.42nmol/ml)组间两两比较均差异显著(P﹤0.01),而富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)和bid组(HRSbid组)两两比较不存在统计学差异(P>0.05);由此可见富含氢气的生理盐水能够有效地降低肾脏缺血再灌注损伤时肾脏功能损害,而富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)与bid(HRSbid组)之间并不存在显著差异。3.4各组缺血再灌注损伤时肾脏组织的细胞凋亡改变:肾脏缺血再灌注24h时,富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)和bid组(HRSbid组)凋亡细胞数为6.41±1.26/HPF及4.69±1.84/HPF,与常规的生理盐水组(NS组)(16.22±2.17/HPF)及正常假手术对照组(SO组)(1.83±0.17/HPF)比较,均差异显著(P﹤0.01),而qd组(HRSqd组)和bid组(HRSbid组)之间比较不存在统计学差异(P>0.05)。3.5肾脏组织各组间P38MAPK的表达:富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)和bid组(HRSbid组)大鼠肾脏组织P38MAPK的表达分别为1.74±0.81、6.02±0.13,与常规的生理盐水组(NS组)(4.12±0.25)及正常假手术对照组(SO组)(0.63±0.42)比较,均差异显著(P﹤0.01),揭示富含氢气的生理盐水(HRS)利于缺血后再灌注肾脏组织的功能保护,而qd组(HRSqd组)和bid组(HRSqd组)之间的比较不存在统计学差异(P>0.05),明确了二者在缺血后再灌注肾脏组织的功能保护作用上不存在剂量上的差异。3.6肾脏组织细胞凋亡与肾脏组织氧化应激反应的关联性:采用直线相关分析提示,各组在缺血后再灌注肾脏细胞凋亡与肾脏组织SOD活力水平呈负关联,r=-0.62(P﹤0.05),与MDA产生呈正关联,r=0.55(P﹤0.05)。3.7肾脏组织两两病理评分比较(P值):常规的生理盐水组(NS组)与正常对照假手术组(SO组)相比较,P=0.00(<0.05),揭示二者之间差异显著,证实常规的生理盐水组(NS组)导致了肾脏组织损害。富含氢气的生理盐水组(HRS组)与正常对照假手术组(SO组)相比较,P=0.06(>0.05),揭示了富含氢气的生理盐水组(HRS组)没有导致明显的肾脏组织损害;富含氢气的生理盐水组(HRS组)与常规的生理盐水组(NS组)相比较,P=0.00(<0.05),二者之间差异显著,揭示富含氢气的生理盐水组(HRS)可以明显减轻肾脏组织损害程度。富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)与富含氢气的生理盐水bid组(HRSbid组)相比较,P=0.95(>0.05),揭示二者之间在减轻肾脏组织损害的作用上无明显的剂量差异。结论:1.给予预处理的富含氢气的生理盐水(HRS)灌胃可以减轻缺血后再灌注导致的肾脏组织结构损伤和功能损害,其表现为显著地提高了肾脏组织的氧化应激反应能力、减少了肾脏组织细胞凋亡的发生,并且使肾血清Scr、BUN和MDA水平降低,从而对肾脏功能起到了有效地保护作用。2.P38MAPK在正常肾脏组织中不表达或仅有少量表达,常规的生理盐水组(NS组)其表达较正常对照假手术组升高显著,揭示了缺血后再灌注导致肾脏组织中P38MAPK的活化;富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)与富含氢气的生理盐水bid组(HRSbid组)均能显著抑制缺血后再灌注肾脏损伤时P38MAPK的过度表达,且二者之间不存在明显的量效差异。3.肾脏组织病理评分显示,肾脏组织损伤在常规的生理盐水组(NS组)表现显著,而在富含氢气的生理盐水qd组(HRSqd组)与富含氢气的生理盐水bid组(HRSbid组)则不明显,且二者之间不存在明显的剂量差异。总结:富含氢气的生理盐水对肾脏缺血后再灌注损伤有明确的保护作用,是预防和减轻临床肾脏缺血再灌注损伤的有效处理方法之一。