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人乳铁蛋白（Human Lactoferrin，hLF）是一种具有高级空间结构的糖蛋白，具有广泛的生物学作用。大量体内体外试验表明：hLF不仅在肠道铁离子的吸收以及抵抗细菌、病毒、真菌、单细胞生物等方面具有重要作用，而且在调节炎症反应、调控基因表达及促进骨骼生长方面也具有重要作用。因此，hLF在疾病防治、营养补充、食物或药品的贮藏等方面具有广阔的应用前景，已成为近几年来研究的热点之一，利用原核和真核表达系统已在生产重组hLF方面做了很多尝试.然而，还有很多问题尚待解决，如蛋白的表达水平较低、翻译后的蛋白缺乏准确的修饰及纯化步骤复杂等，均致使这些方法不适合大规模的生产重组hLF。通过乳腺生产外源蛋白，具有成本低、分离纯化简单、可持续生产、不易污染及所表达的外源蛋白可进行翻译后加工、具有d然蛋白的结构与活性等优点，是生产基因工程药物的理想场所。
鉴于此，本研究构建了hLF cDNA基因乳腺表达载体pGBC-hLF，此载体为随机插入载体。为进行载体的体外表达验证，在此载体中引入了Neo筛选基因，并在山羊乳腺上皮细胞和小鼠乳腺上皮细胞中进行表达验证，为下一步制备稳定整合有人乳铁蛋白cDNA基因的山羊胎儿成纤维细胞提供试验支撑；为了制备转hLF cDNA基因的山羊胎儿成纤维细胞并提高转基因细胞的筛选效率，本研究在pGBC-hLF基础上引入了新霉素基因（Neo）和增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为筛选标记，并利用条件培养液培养转基因细胞，试验发现这样可有效缩短G418药物作用时间，并可得到较纯的转基因细胞；为了下一步获得在基因组中定点整合有hLF cDNA基因的转基因奶山羊，消除位置效应对目的基因的表达影响，本试验又构建了人乳铁蛋白的打靶载体pGBC5-hLF，并在山羊乳腺上皮细胞中进行了载体的生物活性分析，为下一步实验室制备hLF cDNA基因在山羊β-casein基因座定位整合的胎儿成纤维细胞奠定基础。
本试验的具体内容如下：
（1）构建了人乳铁蛋白（hLF）基因的乳腺表达载体pGBC-hLF，F-Neo并验证其在乳腺细胞中的表达情况。本载体以山羊β-casein基因上游包括启动子、外显子1、内含子1、部分外显子2作为5端调控序列，下游包括部分外显子7、内含子7、外显子8、内含子8、外显子9及3部分基因组片段作为3端调控序列，长度分别为6.2 kb和7.1 kb，将hLF基因（目的基因）和Neo基因（筛选标记）分别插入到5端调控序列和3端调控序列的下游，构建成pGBC-hLF-Neo载体，其全长为25.348 kb。为了检测该载体的生物学功能，本试验进一步用脂质体介导法将其分别导入到山羊乳腺上皮细胞GMC和小鼠乳腺上皮细胞株C127中进行表达验证，经G418抗性筛选8-10 d，得到的抗性细胞克隆经催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养，通过RT-PCR和WesternBlot检测表明，本研究所构建的hLF基因乳腺表达载体具有生物学活性，山羊β-casein基因启动子驱动的hLF基因能够在C127和GMC等乳腺上皮细胞中转录翻译，这为下一步建立稳定整合hLF基因奶山羊胎儿成纤维细胞奠定了基础。
（2）构建了带有双标记基因Neo和EGFP的乳腺表达载体pGBC-hLF-Neo-IRES2-EGFP，并通过酶切、PCR、测序鉴定了所构建载体的完整性。通过脂质体转染山羊胎儿成纤维细胞，经G418抗性筛选7-10d后得到绿色荧光细胞克隆；利用单个或多个表达绿色荧光蛋白的转基因细胞分离培养了转基因细胞，并通过试验对比条件培养液和非条件培养液对转基因细胞克隆形成效率的影响，结果证明条件培养液更有利于阳性细胞克隆的形成。借助EGFP和Neo基因作为双筛选标记，可有效的缩短转基因细胞在G418药物中的培养时间，提高了阳性克隆细胞的筛选效率。尝试了利用多重PCR鉴定了表达载体在转基因细胞基因组中的整合情况，避免了单基因PCR导致的假阳性问题；建立了转hLF基因山羊胎儿成纤维细胞，为以后核移植技术生产转基因克隆动物所需的供体细胞的制备提供了一种参考体系。
（3）构建了人乳铁蛋白基因的β-casein基因座的定点打靶载体，此载体以β-casein上游包括启动子，外显子1、内含子1及部分外显子2的6.3kb的调控序列作为5同源长臂，以下游2.4 kb的序列包括外显子8和9作为3同源短臂，Neo基因和tk基因分别作为正负筛选基因，并在Neo基因两端分别加上正向重复序列loxp序列；将人乳铁蛋白基因（hLF）克隆到5同源长臂下游，Neo克隆到β-casein基因7、8外显子之间，tk基因克隆到3同源短臂外侧并用原核序列进行保护；经克隆重组后构建了本地山羊乳腺定点打靶载体，对打靶载体进行酶切鉴定和部分DNA测序，结果证明最终构建的打靶载体符合预先设计的载体图谱；采用脂质体法转入GMC细胞中，以进行打靶载体的表达功能检测，利用RT-PCR和western-blot等检测到了hLF特异性的表达，结果说明本载体能够指导外源基因在动物乳腺细胞内正确表达。