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通过替换MHC结合位点(锚固性残基)是提高表位免疫原性最常用的方法之一。其原理是：虽然T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)对MHC-Ⅰ类限制性表位的识别是特异性的，但这种特异性不是指一个TCR只能与单一的肽段结合，而是指一个T细胞受体可以识别一系列具有某些共同特性的肽段，其中包括一些经过修饰的非天然肽段，即修饰的肽配体(alteredpeptideligand，APL)。APL与T淋巴细胞相互作用后会诱发不同的效应：增强T淋巴细胞活化(激动剂，agonist)或抑制T淋巴细胞活化(拮抗剂，antagonist)。因此，对于免疫原性较低的肿瘤抗原表位肽，通过特定氨基酸位点的修饰可以找到某些具有活化T细胞作用的表位肽，达到增强免疫原性的目的，从而诱发比天然肽更强的CTL反应。在以往的研究中，黑色素瘤分化抗原MART1/MelanA(27-35)(AAGIGILTV)1L、gp100(209-217)(ITDQVPFSV)2M和癌胚抗原CAP-1(YLSGANLNL)6D3条agonists均已应用于临床试验，并观察到较好的临床疗效。
TRP-2，即酪氨酸酶相关蛋白-2，是一种肿瘤相关抗原，与gp100、MART1/MelanA同属于非变异的黑色素瘤细胞分化抗原。TRP-2抗原不但在黑色素瘤广泛表达，在多形性恶性胶质瘤中的表达率为51.2％，TRP-2(180-188)(SVYDFFVWL)表位在人和小鼠的黑色素瘤细胞和人神经胶质瘤细胞均能被递呈。因此TRP-2(180-188)是针对黑色素瘤和神经胶质瘤免疫学治疗的理想靶标。但TRP-2(180-188)天然表位与前述的3条agonists的天然表位一样，在黑色素瘤病人体内存在大量的表位特异性CTL前体，但这些T细胞却处于免疫耐受状态。因此，将TRP-2(180-188)天然表位特定位点氨基酸加以修饰，增强该表位的免疫原性，就可能诱发强有力的CTL反应，从而打破机体对肿瘤抗原表位的耐受，逆转在体低亲和力CTL“无能”状态，提高天然表位的抗肿瘤效果。
在本实验中，首先用MHC分子主要和次要锚着位点的优势氨基酸替换TRP-2(180-188)(SVYDFFVWL)相应位点：P1位用Y，P2位用L或M分别或同时替换天然表位的相应位点。通过多项式方案、量化基序和QSAR方案评测APLs的MHC亲和力，并对APLs与HLA-A*0201分子的三维结构进行分子模拟研究，从中筛选出4条MHC亲和力较高的APLs合成、纯化和鉴定，4条APLs的氨基酸序列为：TRP-22L(SLYDFFVWL)、TRP-22M(SMYDFFVWL)、TRP-21Y2L(YLYDFFVWL)、TRP-21Y2M(YMYDFFVWL)。在体外采用经典的T2/肽结合实验和多肽/MHC复合物稳定性实验评价APLs与HLA-A*0201分子的结合能力。经典的T2/肽结合实验结果提示：4条APLs的MHC结合亲和力均高于天然表位，各肽的MHC亲和力(H值)由高到低为：TRP-22L(2.49)；TRP-22M(2.15)；TRP-21Y2M(1.82)；TRP-21Y2L(1.45)；天然表位(1.32)。多肽/MHC复合物稳定性实验结果提示：经BFA处理后，各肽的多肽/MHC复合物6h保持率由高到低为：TRP-22M(80％)；TRP-21Y2M(71％)；TRP-21Y2L(69％)；天然表位(56％)；TRP-22L(53％)。
CTLs的功能通常用两方面评价：一是检测其分泌细胞因子的能力，比如IFN-γ；另一条途径是检测其细胞毒效应，颗粒酶B的释放是CTL和NK细胞发挥细胞毒效应的一个重要武器，因此检测颗粒酶B的释放可以代表表位特异CTL的细胞毒作用。在本研究中，我们采用了高灵敏度的ELISPOT法来检测表位特异性CTLs分泌细胞因子的能力和释放颗粒酶B的细胞毒效应,用APLs在体外刺激健康人PBMC，诱导出表位特异性的CTLs。对这些CTLs的ELISPOT检测结果表明，与天然多肽相比，TRP-22M特异的CTLs能识别负载天然表位的T2细胞，并分泌较高水平的IFN-γ和颗粒酶B；但TPR-22M特异性的CTL在识别肿瘤细胞株LB373-MEL(HLA-A*0201+，TRP-2+)时，其分泌颗粒酶B的水平与天然多肽或其余3条APLs特异性的CTLs无明显差异。在体免疫学实验采用HLA-A*0201/Kb转基因鼠，用PADRETh表位辅助APLs免疫小鼠。11天后取出脾细胞，体外用相应表位肽刺激5天后作效应细胞，用于小鼠的IFN-γELISPOT检测。结果显示，与天然表位和其他APLs相比，TRP-22M诱导的CTL能识别负载天然表位的T2细胞，且分泌IFN-γ的能力最强，其在体免疫原性显著增强。
综上所述，与天然表位相比，TRP-22M能形成更稳定的多肽/MHC复合物，在体内和体外免疫学实验中，TRP-22M较天然表位活化CTL的能力显著提高，能诱发比天然肽更强的CTL反应等免疫学效应，由此可以推测：TRP-22M增强的免疫学效应可能与其较强的MHC结合稳定性相关。在后续的研究中将进一步验证TRP-22M对其他TRP-2+肿瘤细胞的杀伤效应和应用于黑色素瘤和神经胶质瘤病人的临床试验。