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沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌,对人类的身体健康和畜牧业的健康发展造成严重危害.近年来,沙门氏菌病在世界各国频频爆发,呈现出耐药范围扩大、致病性增强、传播广泛的特点.抗生素在人医临床和畜牧业的广泛使用,使得沙门氏菌耐药性问题日益严重,在抗生素持续压力下,沙门氏菌必然发生变异,以适应药物环境.为了阐述抗生素压力下沙门氏菌的变异规律和对毒力的影响,本论文从mRNA水平、蛋白水平和细胞水平系统地研究了沙门氏菌在5种抗生素(阿莫西林、庆大霉素、氟苯尼考、多西环素和环丙沙星)的压力下,6种主要毒力相关基因(SPI-1的毒力相关标志基因inva,invE和hilA,粘附基因fimA、肠毒素基因stn和调控基因phoQ)在不同耐药表型菌株间的变异规律,及对细胞粘附力和侵袭力的影响.主要研究结果如下:
1.沙门氏菌主要毒力相关基因的筛查
采用PCR方法对invA、invE、hild、fimA、phoQ和sin基因在150株沙门氏菌临床分离株和鼠伤寒沙门氏菌标准株(C77-31和C77-32)及其药物诱导株中的存在情况进行了筛查.结果显示:所有受试菌株均检测到invA、fimA和stn三种毒力基因,但3株耐药谱型均为Amo/Flor/Dox/Cip的沙门氏菌临床分离株未检测到invE、hilA和phoQ基因,这种沙门氏菌临床耐药株毒力基因的缺失可能由环丙沙星引发.
2.沙门氏菌主要毒力相关基因mRNA水平差异
采用实时荧光定量PCR方法对临床分离的沙门氏菌敏感株和耐药株、标准菌诱导耐药株与平行传代敏感株的6种主要毒力相关基因mRNA水平进行比较.结果显示:阿莫西林、氟苯尼考和多西环素临床耐药组和敏感组invA、invE、fimA、phoQ和stn基因mRNA表达差异显著(P<0.05),环丙沙星差异极显著(P<0.01);庆大霉素诱导耐药株较平行传代株6种毒力相关基因mRNA表达水平有所增强,阿莫西林、氟苯尼考、多西环素和环丙沙星诱导耐药株较平行传代株6种毒力相关基因mRNA表达水平均有所减弱,环丙沙星诱导耐药株减弱程度最大.
对不同浓度药物环境下6种主要毒力相关基因mRNA水平差异比较,结果显示:沙门氏菌添加阿莫西林、庆大霉素、氟苯尼考和环丙沙星培养后,invA、invE、hilA和fimA基因mRNA表达明显减弱,phoQ和stn基因mRNA表达致弱程度较小;6种毒力相关基因均表现为随着药物浓度的增高,mRNA表达水平递减;添加多西环素培养后,各毒力基因mRNA表达仅有轻微减弱,且增大药物浓度各基因mRNA表达未见明显变化.
3.沙门氏菌invE和fimA基因序列分析
通过代表性临床敏感株和耐药株、C77-31诱导前后敏感株和耐药株invE基因序列比对分析,结果显示:不同耐药表型的沙门氏菌invE基因之间没有明显的变化规律,鼠伤寒沙门氏菌C77-3l株诱导后invE基因内部发生的点突变(711T-C,850C-T),是在培养基中生存进化的适应性突变,与抗生素的作用没有直接联系.
4.沙门氏菌InvE和FimA蛋白表达差异原核表达
沙门氏菌侵袭蛋白InvE和粘附蛋白FimA,制备InvE和FimA蛋白抗体,采用western blotting分析不同耐药表型临床菌株、标准菌诱导耐药株与平行传代敏感株InvE和FimA蛋白表达的差异情况.结果显示:受试菌株InvE和FimA蛋白表达水平与其mRNA表达水平呈现相同的变化规律,阿莫西林、氟苯尼考、多西环素和环丙沙星诱导耐药株InvE和FimA蛋白表达减弱,环丙沙星耐药株InvE蛋白(0％相对于18.41％,P<0.01)和FimA蛋白(12.41％相对于32.18％,P<0.01)的表达减弱程度最大,庆大霉素诱导耐药株InvE蛋白(23.12％相对于18.41％,P<0.01)和FimA蛋白(38.02％相对于32.18％,P<0.01)表达较平行传代株则有所增强.
5.沙门氏菌对细胞粘附力和侵袭力差异
测定了沙门氏菌临床分离株和标准菌诱导耐药株对Hela细胞的粘附率和侵袭率.结果显示:诱导株粘附率变化规律与fimA基因mRNA水平和蛋白表达水平变化规律一致,侵袭率变化规律与invE基因mRNA水平和蛋白表达水平的变化规律一致,阿莫西林、氟苯尼考、多西环素和环丙沙星诱导耐药株对Hela细胞的粘附率和侵袭率较平行传代株均有所下降,庆大霉素诱导耐药株较平行传代株对Hela细胞的粘附率(1.8％相对于1.5％,P<0.05)和侵袭率(0.253％相对于0.221％,P<0.05)则略有上升.
本研究从mRNA水平、蛋白水平和细胞水平阐明了在阿莫西林、氟苯尼考、多西环素和环丙沙星的单一药物持续压力下,沙门氏菌的毒力减弱,而庆大霉素则可增强沙门氏菌的毒力.