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背景:多发性骨髓瘤(MM)是发生于B细胞终末阶段浆细胞的恶性血液系统肿瘤,至今仍不可治愈。其特征之一为骨髓中多部位受恶性浆细胞累及,并浸润其他器官。临床上,约有5%的MM患者进展为浆细胞白血病。由于现有的治疗手段使MM患者总的生存时间延长,因此临床上观察到MM患者髓外浸润的发生率升高。虽然先进的治疗手段不断出现,但MM患者的预后仍然很差。众所周知,肿瘤细胞的侵袭能力不仅是恶性肿瘤的重要标志,还与较差的临床预后紧密相关。骨髓瘤细胞迁移是非常有害的病理过程,使细胞具有侵袭和播散能力。然而目前调节骨髓瘤细胞迁移至骨髓并侵袭其他部位的机制却知之甚少。如果这些机制能够被阐明,对于寻找新的治疗方法将有很大的帮助。多发性骨髓瘤患者的髓外浸润事件常常与骨髓瘤细胞增强的侵袭活性、复杂的细胞遗传学异常伴随发生。基因的异常被认为是多发性骨髓瘤疾病致病的重要因素。然而,目前使骨髓瘤细胞具有增强的侵袭活性的分子机制尚不明确。与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin hemology deleted on chromosome ten gene,PTEN)是近年来发现的肿瘤抑制基因,PTEN蛋白具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重活性,其脂质磷酸酶活性可以调控细胞的增殖、凋亡以及细胞周期。其蛋白磷酸酶活性可以通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、黏着斑激酶(FAK)的磷酸化等信号通路,调节细胞的迁移及黏附。PTEN可以通过多种信号传导通路影响细胞生长、分化、黏附及细胞周期进程,抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移,并促进肿瘤细胞凋亡。研究发现,多种恶性肿瘤细胞株和原发肿瘤中存在PTEN基因的突变、等位基因的缺失或低表达,从而影响其肿瘤抑制功能。近年来PTEN在造血系统肿瘤中的作用逐渐受到重视。PTEN蛋白量或质的异常在造血干细胞分化、白血病发病以及白血病复发中起着重要作用。关于多发性骨髓瘤的研究中,有研究应用间期FISH,发现71例多发性骨髓瘤患者中有4例(5.6%)存在PTEN基因片段缺失,4例患者均为Durie-Salmon分期Ш期。10例原发性浆细胞白血病(PCL)患者中2例(20%)、10种人MM细胞株(HMCLs)中有两种(OCI-My6细胞和U266细胞,20%)发现有PTEN杂合性缺失。PTEN缺失被发现于进展期,并且在PCL和HMCL中发生率明显升高,这表明PTEN缺失与MM疾病的进展有关。目前,对于PTEN是否能够影响MM细胞的侵袭活性,PTEN以及PTEN信号转导通路在MM患者中的作用知之甚少。因此,本文应用腺病毒介导的PTEN基因转染人类多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和纯化的原代多发性骨髓瘤细胞,使MM细胞高表达PTEN基因。并且考虑到RPMI8226细胞本身表达PTEN基因,因此进一步应用PTEN-siRNA转染细胞,使PTEN基因下调,从而观察野生型PTEN对骨髓瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期进程、侵袭活性的影响,并检测PTEN/FAK/MMP信号通路在MM细胞中的表达,以了解其可能的作用机制,为基因治疗多发性骨髓瘤提供理论依据。研究分以下三部分:第一部分PTEN、FAK在多发性骨髓瘤患者中的表达及与临床分期、髓外浸润的关系目的检测从MM患者骨髓单个核细胞经过纯化分离的骨髓瘤细胞中PTEN及FAK mRNA及其蛋白水平变化,分析MM患者中两者的关系及与多发性骨髓瘤临床分期、髓外浸润的关系,以探讨二者在多发性骨髓瘤发病中的可能作用。方法收集55例MM患者骨髓单个核细胞,应用CD138抗体将MM细胞进行纯化,同时与20个缺铁性贫血患者骨髓单个核细胞对比,并将患者按Durie-Salmon分期和是否伴有髓外浸润进行分组,并进一步进行比较。实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测PTEN、FAK mRNA表达,Western blot法测定其蛋白表达水平。结果1. 55例MM患者PTEN mRNA表达水平为(0.723±0.059),对照组的表达水平为(0.984±0.359),二者相比有显著性差异(P<0.05)。FAK mRNA表达水平为(1.072±0.626),对照组的表达水平为(0.433±0.240),二者相比有显著性差异(P<0.01)。Spearman双变量相关分析结果显示,MM患者中PTEN mRNA与FAK mRNA表达水平呈显著性负相关(r=-0.560,P<0.01)。2.按Durie-Salmon分期将MM患者分为两组。Ⅰ+Ⅱ期MM患者组15例,PTEN mRNA表达水平为(0.909±0.429)。Ⅲ期MM患者组40例,PTEN mRNA表达水平为(0.653±0.347),Ⅰ+Ⅱ期MM患者组与对照组比较无统计学差异(P>0.05),Ⅲ期MM患者组与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。Ⅰ+Ⅱ期MM患者组和Ⅲ期MM患者组比较有显著性差异(P<0.05)。Ⅰ+Ⅱ期MM患者组FAK mRNA表达水平为(0.726±0.317),Ⅲ期MM患者组为(1.224±0.667),二组分别与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。Ⅰ+Ⅱ期MM患者组和Ⅲ期MM患者组比较有显著性差异(P<0.01)。3.按是否伴有髓外浸润将所有多发性骨髓瘤患者分为两组。伴髓外浸润组共12例,PTEN mRNA表达水平为(0.656±0.296),不伴髓外浸润患者共43例,PTEN mRNA表达水平为(0.742±0.407),二组分别与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),伴髓外浸润组和无髓外浸润组相比,无统计学差异(P>0.05)。伴有髓外浸润组FAK mRNA表达水平为(1.791±0.618),无髓外浸润组为(0.878±0.468),二组分别与对照相比差异均有统计学意义(P<0.01)。伴髓外浸润组和无髓外浸润组相比差异亦具有统计学意义(P<0.01)。4. 6份对照骨髓的单个核细胞PTEN均阳性表达,平均蛋白表达水平为(0.332±0.119),T-FAK蛋白均阳性表达,平均蛋白表达水平为(0.106±0.090),p-FAK在6份对照骨髓中均未测出。5.选择12例Ⅲ期MM患者行Western blot检测,其中无髓外浸润MM患者6例,伴髓外浸润患者6例。PTEN蛋白在12例Ⅲ期MM患者中有3例不表达,9例表达,平均蛋白表达水平为(0.081±0.087),与对照组PTEN表达水平相比,差异有统计学意义(p<0.01)。T-FAK蛋白在Ⅲ期MM患者中均表达,平均蛋白表达水平为(0.257±0.119),与对照组表达水平比较差异有统计学意义(0.01<p<0.05)。p-FAK在11例患者均有不同程度的表达,平均蛋白表达水平为(0.082±0.040)。与对照组阳性率比较差异有统计学意义(x2=14.14,p<0.01)。6.无髓外浸润的6例MM患者和伴髓外浸润的6例MM患者PTEN蛋白的平均表达水平分别为(0.093±0.091)和(0.069±0.089),T-FAK蛋白的平均表达水平分别为(0.257±0.126)和(0.257±0.123),p-FAK蛋白的平均表达水平分别为(0.053±0.142)和(0.097±0.038),p-FAK蛋白的平均表达水平在两组之间有显著性差异(p<0.05), PTEN和T-FAK在两组之间无明显差异(P>0.05)。结论PTEN、FAK mRNA在多发性骨髓瘤患者中的表达水平与正常骨髓比较有显著性差异,Ⅲ期MM患者存在PTEN蛋白低表达和p-FAK蛋白高表达,MM患者PTEN和FAK表达水平可能与MM患者疾病的进展及髓外浸润密切相关,在MM的发生发展中PTEN和FAK存在互相拮抗的关系。第二部分腺病毒介导的野生型PTEN基因对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡、侵袭力的影响及其机制的研究目的应用携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad- PTEN-GFP)转染RPMI8226细胞、纯化的原代多发性骨髓瘤细胞和正常人骨髓细胞,使之高表达PTEN基因,以探讨抑癌基因-野生型PTEN基因对MM细胞增殖、凋亡、细胞周期进程和侵袭活性的影响,并对其分子作用机制进行探讨。方法将Ad-PTEN-GFP或空载体腺病毒(Ad-GFP)转染RPMI8226细胞系以及纯化的原代多发性骨髓瘤细胞和正常人骨髓细胞。MTT检测细胞生长曲线;流式细胞仪检测腺病毒转染细胞的转染效率、细胞凋亡率和细胞周期分布;光镜和电镜下检测细胞形态变化;Hoechst33342荧光染色检测细胞细胞增殖及凋亡;transwell小室实验检测细胞侵袭活性;荧光定量PCR(FQ-PCR)检测mRNA水平变化;Western Blot检测蛋白水平变化。结果1.流式细胞仪检测结果证实,腺病毒转染RPMI 8226细胞在第2天达到最高转染率,MOI=100时转染效率为83.1±6.4%。转染经过纯化的原代多发性骨髓瘤细胞和正常人骨髓细胞效率较低,MOI=100时平均转染效率分别为(26.4±11.9)%和(29.3±10.5)%。2. Ad- PTEN-GFP或Ad-GFP转染RPMI8226细胞72h,PTEN mRNA表达水平在Ad-PTEN-GFP组为19.244±5.065,Ad-GFP组为1.031±0.259,二组相比存在显著性差异(p<0.01)。PTEN蛋白表达水平Ad-PTEN-GFP组为1.426±0.201, Ad-GFP组为0.783±0.176,二者相比,差异具有统计学意义(p<0.01)。3. Ad-PTEN-GFP、Ad-GFP分别转染RPMI8226细胞、纯化的原代多发性骨髓瘤细胞和正常人骨髓细胞,在MOI=100时,第4d细胞生长抑制率为42.01±7.92%,33.37±7.12%和8.42±3.09%。RPMI8226细胞和纯化的原代多发性骨髓瘤细胞与正常人骨髓细胞相比,生长抑制率存在统计学差异(P<0.01)。4. RPMI8226细胞转染Ad-PTEN-GFP、Ad-GFP 72h后,Ad-GFP组细胞呈圆形或椭圆形,体积较大,染色质疏松,透射电镜下染色质细致均匀,核仁清晰,细胞器完整,细胞微绒毛清晰可见,无凋亡的形态学改变。而转染Ad-PTEN-GFP组细胞,部分细胞体积缩小,染色质高度浓缩边集,核碎裂、溶解。透射电镜可清楚观察到细胞染色质碎裂边集,细胞器结构不完整。5. PTEN基因转染RPMI 8226细胞72 h后,各组细胞凋亡率分别为:未转染组(4.56±2.02)%,Ad-GFP组(5.51±2.43)%,Ad-PTEN-GFP组(35.02±6.80)%,Ad-PTEN-GFP组与未转染组和Ad-GFP组的细胞凋亡率相比,差异有统计学意义(P<0.01)。PTEN基因转染纯化的原代多发性骨髓瘤细胞72 h后,各组细胞凋亡率分别为:未转染组(3.62±1.99)%,Ad-GFP组(3.45±2.87)%,Ad-PTEN-GFP组(20.97±7.93)%,Ad-PTEN-GFP组与未转染组和Ad-GFP组的细胞凋亡率相比差异有统计学意义(P<0.01)。PTEN基因转染正常人骨髓细胞72 h后,各组细胞凋亡率分别为:未转染组(1.04±0.79)%,Ad-GFP组(1.32±1.01)%,Ad-PTEN-GFP组(4.01±2.48)%,Ad-PTEN-GFP组与未转染组和Ad-GFP组的细胞凋亡率相比差异有统计学意义(P<0.05)。6.以MOI=100,Ad-PTEN-GFP转染RPMI8226细胞3天,处于G2/M期的细胞比例逐渐增加,由16.20%升至51.10%,细胞周期阻滞在G2/M期。另外,细胞周期图出现亚二倍体凋亡峰,凋亡峰显示细胞凋亡率为21.6±2.35%,显著高于Ad-GFP转染组的4.8±0.74%和未转染组的4.2±0.51%(P<0.05)。7. Transwell小室实验结果显示,在MOI=100时,转染Ad-GFP与Ad-PTEN-GFP24h,RPMI 8226细胞未转染组、Ad-GFP组和Ad-PTEN-GFP组黏附于下室面的具有荧光的细胞数量分别为:50.16±7.60,52.65±7.39和23.50±6.12,未转染组和Ad-GFP组与Ad-PTEN-GFP组比较,黏附于下室面的具有荧光的细胞数量差异有明显统计学意义(P<0.01)。纯化的原代多发性骨髓瘤细胞未转染组、Ad-GFP组和Ad-PTEN-GFP组黏附于下室面的具有荧光的细胞数量分别为:57.66±11.63,56.01±8.45和30.84±7.81,未转染组和Ad-GFP组与Ad-PTEN-GFP组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。8. mRNA表达:以MOI=100转染RPMI8226细胞后72h,结果显示在未转染组、Ad-GFP组、Ad-PTEN-GFP组,PTEN mRNA的相对表达水平分别为1.020±0.228,1.031±0.259和19.244±5.065,Ad-PTEN-GFP组与Ad-GFP组相比,PTEN mRNA表达水平显著增高(P<0.01)。凋亡相关基因Survivin mRNA相对表达水平分别为1.045±0.273,1.017±0.269和0.380±0.059 , Caspase-3 mRNA相对表达水平分别为1.018±0.227 ,0.980±0.254和2.029±0.420 , Caspase-7 mRNA相对表达水平分别为1.005±0.191,1.013±0.205和1.614±0.311。Ad-GFP组与Ad-PTEN-GFP组比较,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。FAK mRNA相对表达水平分别为0.987±0.300;0.958±0.258;0.446±0.110(P<0.05)。MMP-2 mRNA相对表达水平分别为0.992±0.251;0.984±0.270;0.469±0.147(P<0.05)。MMP-9 mRNA相对表达水平分别为0.983±0.238;0.972±0.257;0.366±0.104(P<0.01)。9.蛋白表达:以MOI=100转染RPMI8226细胞后72h,在未转染组、Ad-GFP组、Ad-PTEN-GFP组,PTEN相对表达水平分别为0.732±0.159;0.783±0.176;1.426±0.201,Ad-PTEN-GFP组与Ad-GFP组相比,PTEN蛋白表达水平显著增高(P<0.01)。Survivin蛋白表达水平分别为0.348±0.081,0.356±0.090和0.082±0.023 ( P<0.01 )。T-FAK蛋白表达水平分别为1.178±0.302,1.137±0.282和0.730±0.197(P<0.05)。p-FAK蛋白表达水平分别为0.289±0.083,0.304±0.095和0.068±0.027(P<0.01)。MMP-2蛋白表达水平分别为0.622±0.220,0.691±0.238和0.155±0.076(P<0.01)。MMP-9蛋白表达水平分别为0.358±0.094,0.339±0.143和0.098±0.060(P<0.05)。10. Caspase-3、-7蛋白活性:Ad-PTEN-GFP以MOI=100转染RPMI 8226细胞72h,Caspase-3/7活性为(0.786±0.081),高于Ad-GFP组(0.373±0.039)和未转染组(0.370±0.034),差异有统计学意义(P<0.01)。结论过表达PTEN基因能够明显抑制RPMI8226细胞和原代多发性骨髓瘤细胞增殖,诱导其凋亡,并调控多种凋亡相关分子,使细胞周期阻滞在G2/M期,细胞侵袭能力降低,其分子机制可能与PTEN抑制FAK/MMP信号途径有关。第三部分抑制PTEN基因表达对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖、侵袭力的影响及其机制的研究目的应用PTEN-siRNA使PTEN基因表达下降,探讨PTEN基因对RPMI8226细胞增殖、细胞周期和侵袭力的影响,并对其分子作用机制进行探讨。方法应用针对小鼠PTEN序列的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染RPMI 8226细胞,阻断内源性PTEN的表达。MTT检测细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期分布;transwell小室实验检测细胞侵袭活性;荧光定量PCR(FQ-PCR)检测mRNA水平变化,Western Blot检测蛋白水平变化。结果1.检测PTEN mRNA及蛋白检测来测定PTEN-siRNA的转染效果。结果显示在PTEN-siRNA转染RPMI8226细胞48h,PTEN mRNA表达水平在NS-siRNA转染组为1.107±0.306 , PTEN-siRNA转染组为0.143±0.045,二组相比存在显著性差异(p<0.01)。PTEN蛋白表达水平在NS-siRNA转染组为0.699±0.130,PTEN-siRNA转染组为0.089±0.025,二者相比差异具有统计学意义(p<0.01)。2. MTT结果显示,转染PTEN-siRNA第4d,细胞生存率为(141.55±8.34)%,NS-siRNA转染组和PTEN-siRNA转染组OD 490值比较有统计学意义(P<0.01)。3.细胞周期分析显示PTEN-siRNA转染RPMI8226细胞48h后,与未转染细胞相比,处于G0/G1期细胞比例升高,G2/M期和S期细胞比例降低,凋亡峰显示凋亡的细胞比例减少。4. PTEN-siRNA转染RPMI8226细胞后24h,未转染组、NS-siRNA转染组和PTEN-siRNA转染组黏附于下室面的细胞数量分别为:49.33±7.63、47.17±7.76和79.50±11.89,NS-siRNA和PTEN-siRNA二组相比,差异有显著统计学意义(P<0.01)。5. mRNA表达:PTEN-siRNA转染RPMI8226细胞后48h,未转染组、NS-siRNA组、PTEN-siRNA组,PTEN mRNA相对表达水平分别为1.049±0.248;1.107±0.306;0.143±0.045,NS-siRNA组和PTEN-siRNA组相比有统计学意义(P<0.01)。凋亡相关基因Survivin mRNA相对表达水平分别为1.013±0.207,1.008±0.191和2.534±0.438,Caspase-3 mRNA相对表达水平分别为1.008±0.198,0.979±0.174和0.473±0.089,Caspase-7 mRNA相对表达水平分别为1.015±0.196,1.003±0.204和0.510±0.090。NS-siRNA和PTEN-siRNA二组相比,差异有显著统计学意义(P<0.01) FAK mRNA相对表达水平分别为0.979±0.308;0.940±0.301;2.176±0.61(2P<0.01)。MMP-2 mRNA相对表达水平分别为1.002±0.213;0.998±0.206;2.793±0.74(0P<0.01)。MMP-9 mRNA相对表达水平分别为1.086±0.219;1.029±0.280;1.980±0.733(P<0.05)。6.蛋白表达:PTEN-siRNA转染RPMI8226细胞后48h,未转染组、NS-siRNA组、PTEN-siRNA组,PTEN蛋白相对表达水平分别为0.647±0.124,0.699±0.130和0.089±0.025,NS-siRNA组与PTEN-siRNA组相比有显著性差异(P<0.01)。Survivin蛋白表达水平分别0.312±0.089,0.324±0.086和1.247±0.321(P<0.01)。T-FAK蛋白表达水平分别为0.983±0.217;0.945±0.226;1.637±0.380(P<0.05)。p-FAK蛋白表达水平分别为0.345±0.086;0.390±0.091;1.054±0.272(P<0.01)。MMP-2蛋白表达水平分别为0.233±0.080;0.295±0.092;1.265±0.383(P<0.01)。MMP-9蛋白表达水平分别为0.237±0.083;0.221±0.084;0.544±0.161(P<0.05)。7. Caspase-3、-7蛋白活性:PTEN-siRNA转染RPMI 8226细胞72h,Caspase-3/7活性为(0.073±0.008),低于NS-siRNA组(0.369±0.038)和未转染组(0.370±0.034),差异有统计学意义(P<0.01)。结论转染PTEN干扰RNA能够促进RPMI8226细胞增殖,并使细胞凋亡减少,细胞周期检测结果提示处于G0/G1期细胞比例升高,G2/M和S期细胞减少,细胞侵袭能力增加。可能与PTEN表达水平降低,并进一步引起凋亡相关基因分子以及FAK/MMP信号转导通路信号分子mRNA和蛋白表达水平的异常有关。