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姜花是我国华南地区重要的香型鲜切花,市场需求量大,具有重要的经济价值。目前栽培中主要靠无性繁殖,自然繁殖系数低,且近年来姜瘟病肆虐,严重影响了姜花的产量和品质。抗菌肽及人工合成的抗菌肽基因可以在植物体内表达并具有杀菌活性,将具有广谱抗菌能力的抗菌肽D的编码基因导入到姜花,有望获得具有抗病性状的优良姜花新品种。
本研究以白姜花为材料,建立并优化了白姜花的组培快繁体系,并在此基础上初步建立了白姜花农杆菌介导的遗传转化体系,初步探索了基因枪转化法中的各种适宜参数、对白姜花转AP—D基因的抗性植株进行了PCR检测。对课题组留下的红姜花转AP—D基因的抗性植株进行了PCR检测和Southern blot检测,为进一步培育姜花抗病新品种提供了材料。试验结果表明:
1、采用2% NaClO对白姜花小花苞进行表面消毒12 min,污染率降低为11.54%,花丝愈伤组织诱导率可达为63.64%。白姜花的花丝、花药、叶片(大田叶片、无菌苗叶片)、假茎薄片均可诱导出愈伤组织,其中以花丝诱导愈伤最容易,且愈伤组织状态较好。各种外植体诱导愈伤组织从易到难依次是:花丝、大田叶片、假茎薄片、无菌苗叶片、花药;最高诱导率分别是63.64%、60%、37.14%、27.50%、15%。白姜花花丝愈伤组织增殖的适宜培养基配方为:MS+6—BA1.0 mg/L+NAA4.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8.5 g/L,增殖倍数达5倍以上。白姜花花丝愈伤分化的适宜培养基为MS+6—BA3.5 mg/L+ NAA0.1 mg/L+CH500 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8g/L,分化率达51.79%,平均分化芽数3.78个。采用带透气孔的滤膜封盖培养瓶可明显改善瓶内材料的生长状况,与瓶盖相比,玻璃化现象减少、愈伤组织鲜重增加较多、胚性愈伤较多。液体悬浮培养对白姜花愈伤组织的增殖和体细胞胚的诱导与固体培养相比,无明显优势。
2、白姜花花丝愈伤组织轰击前4—6 h接种在MS+6—BA3.5 mol/L+NAA0.1 mol/L+山梨醇0.2 mol/L+甘露醇0.2 mol/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L的高渗培养基上高渗培养,在真空度为25—27 in.Hg的条件下,采用1100 psi的可裂膜,白姜花愈伤组织基因枪法转化的适宜轰击距离为6 cm,轰击次数为1次,GUS瞬时表达率可达33.33%。平均染色面积达26.92%。
3、以花丝愈伤组织分化培养基作为预培养、共培养及筛选培养的培养效果明显较花丝愈伤组织增殖培养基为好。在预培养时间、共培养时间均为3d、共培养基中添加100 mg/L的AS时,农杆菌菌株LBA4404侵染15 min的效果好于其它处理。在抗性芽的筛选过程中,采用逐渐加大Hyg浓度至20 mg/L后,采用5 mg/L的Hyg至抗性芽分化出苗筛选方式,可以提高抗性芽的数量、缩短侵染后从愈伤组织到抗性苗的时间。
4、对5株白姜花抗性植株进行PCR检测,有1株PCR结果呈阳性,初步证明抗菌肽D基因已整合到白姜花中。对220株红姜抗性植株进行PCR检测,有14株结果成阳性,对其中6株进行Sothern blot检测,有2株有明显的杂交信号,其中一株为单拷贝,一株为双拷贝。