基于CRISPR/Cas9基因编辑技术创造高油酸低亚麻酸油菜新材料

• 作 者: 姚燕喃
• 机 构: 华中农业大学
• 出 处: 华中农业大学
• 发表日期: 2018年期
• 关键词: 油菜 基因编辑 亚麻酸 油酸 遗传转化

油菜(Brassica napus L.)是我国重要的油料作物，脂肪酸的组成直接决定菜籽油的食用价值和营养品质。本研究利用CRISPR/Cas9技术，对控制油酸含量的FAD2基因、控制亚麻酸含量的FAD3基因进行编辑，通过遗传转化的方法获得一系列转基因编辑单株。主要取得的成果如下：　　1. 在甘蓝型油菜中 FAD2 和 FAD3 基因通常以多拷贝的形式存在，根据 QTL定位与基因序列分析的结果，本研究分别选取了BnaA.FAD3.b（LG A4）、BnaC.FAD3.b （LG C4）、BnaA.FAD2.a（LG A5）、BnaC.FAD2.a（LG C5）分别构建了双靶位点的CRISPR/Cas9植物表达载体。　　2. 进行了农杆菌介导的遗传转化体系的优化，及不同油菜材料对抗生素浓度的耐受性分析。确定获得最佳转化效率的实验条件，并采用农杆菌介导的下胚轴转化的方式，对甘蓝型油菜621R、DT、627R、ZY50和7-5等材料进行遗传转化，最终得到了不同CRISPR/Cas9转化的甘蓝型油菜1623株。　　3. 转基因单株阳性检测结果表明，在FAD2基因收获的1537株转基因单株中，阳性单株有164株，阳性率为10.6%；在FAD3基因收获的86株转基因单株中，阳性单株有6株，阳性率为7.0%；不同受体材料转化效率有一定差异。　　4. 对检测出的转基因阳性单株进行编辑检测，并对编辑单株进行TA克隆分析。在本研究FAD2靶基因获得的164株转基因阳性单株中，有118株在靶位点处或靶位点上下游成功编辑，编辑效率为75.6%；而在FAD3靶基因获得的6株阳性苗中，仅有1株成功被编辑，编辑效率为16.7%。不同受体材料的编辑效率差异较大，其中阳性率最高的受体材料反而编辑效率最低。　　5. 对获得的突变体测序数据与靶基因核酸序列进行比对，在本研究中获得的编辑材料中，单碱基插入造成的移码突变为主要的编辑类型，占各种编辑类型的58.5%，其中插入C频率最高为56.6%。大于2bp的突变占6.8%，主要以2-52bp的缺失为主。　　6. 比较了多种脂肪酸测定的方法，并对当代FAD2转基因单株进行脂肪酸含量测定，其中油酸含量显著增高，最高的单株超过83%。