论文部分内容阅读
目的：
PRC17是一个新近发现的癌基因,在多种肿瘤组织和细胞株中高表达。寻找和初步鉴定PRC17癌蛋白可能的相互作用蛋白,将有助于阐明PRC17的功能和其导致细胞恶性转化的机制,为人类肿瘤的早期诊断和防治提供新线索。
方法：
为寻找PRC17癌蛋白可能的相互作用蛋白,以pGEX-6P-1为载体,构建了GST-PRC17融合蛋白原核表达质粒PRC17/pGEX;将pGEX-6P-1和PRC17/pGEX质粒分别转导入大肠杆菌BL21并经IPTG大量诱导表达GST和GST-PRC17蛋白后,用Glutathione Sepharose 4B对GST和GST-PRC17蛋白分别进行了亲和纯化。
以纯化的GST蛋白为对照,将GST-PRC17融合蛋白与HeLa细胞裂解物进行GSTPull-down分析；沉淀的蛋白进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色后,将PRC17可能的结合蛋白条带进行肽指纹(PMF)图和串联质谱(MS/MS)分析；将获得的数据输入蛋白质数据库进行检索,以获得与数据匹配的蛋白信息,初步筛选出PRC17蛋白的可能相互作用蛋白。
为初步鉴定筛选出的β微管蛋白与PRC17之间的相互作用,以GST蛋白为对照,用GST-PRC17融合蛋白与HeLa细胞裂解物进行GSTpull-dwon分析；用抗β微管蛋白抗体进行Western Blot分析以检测沉淀中的β微管蛋白。
为研究PRC17癌蛋白在细胞内的分布,以pEGFP为载体,构建了EGFP-PRC17绿色荧光蛋白真核表达质粒PRC17/pEGFP;为研究β微管蛋白在细胞内的分布,用RT-PCR方法,从制备的HeLa细胞总RNA中扩增了β微管蛋白2C的cDNA完整开放读码框架(openreading frame,ORF),将之插入pDsRed-Monomer载体后,得到DsRed-β微管蛋白2C(红色荧光蛋白)真核表达质粒TubB2C/pDsRed。将EGFP-PRC17/pEGFP和DsRed-TubB2C/pDsRed质粒共转染HeLa细胞后,在荧光显微镜下观察PRC17和β微管蛋白在细胞内的定位。
结果：
构建的GST-PRC17融合蛋白原核表达质粒PRC17/pGEX经BamH I和Xho I双酶切后出现1662 bp特征性片段,PRC17 cDNA序列经测序证实无误。大肠杆菌BL21在分别用PRC17/pGEX和pGEX-6P-1转化后,由IPTG诱导表达的蛋白分子量均符合预期,为89.2 kDa(GST-PRC17融合蛋白)和28.4 kDa(GST蛋白),而未转入任何质粒的BL21和转入pGEX-6P-1或GST-PRC17/pGEX质粒而未经IPTG诱导的BL21阴性对照,则在相应分子量处仅见非常弱的非特异性蛋白条带。Western Blot分析结果显示抗GST抗体可特异性识别GST-PRC17蛋白,但不能识别阴性对照的非特异性蛋白。在非变性条件下(1％NP40裂解液和超声破碎仪裂解细菌菌体),GST-PRC17和GST蛋白被用Glutathione Sepharose 4B进行了初步亲和纯化。用纯化的GST和GST-PRC17蛋白与HeLa细胞裂解物进行GST Pull-down分析,发现多条PRC17的可能结合条带,其中以大约23 kDa,55 kDa和100 kDa分子量处的三条蛋白条带较明显,而阴性对照GST蛋白和未与HeLa细胞裂解物进行结合反应的GST-PRC17蛋白的相应分子量处无明显蛋白条带或蛋白条带非常弱。经肽指纹图(PMF)和串联质谱(MS/MS)检测和蛋白质数据库检索,两条蛋白条带分别匹配β微管蛋白和TBC1D3蛋白(即PRC17自身),而另一蛋白条带无高可信度的匹配结果。
为初步鉴定PRC17与β微管蛋白之间的相互作用,以GST蛋白为对照,用GST-PRC17融合蛋白与HeLa细胞裂解物进行GST pull-dwon实验后,用抗β微管蛋白抗体进行Western Blot分析,显示PRC17与β微管蛋白结合,而阴性对照GST蛋白并不结合β微管蛋白,证实PRC17蛋白可特异性结合β微管蛋白。
将构建并鉴定的EGFP-PRC17(绿色荧光蛋白)和DsRed-β微管蛋白(红色荧光蛋白)真核表达质粒共转染HeLa细胞后,在荧光显微镜下发现PRC17分布在细胞浆内及细胞质膜上,细胞内的PRC17主要呈小泡样结构广泛分布；而β微管蛋白在细胞内也呈广泛分布。PRC17和β微管蛋白在细胞内的分布有待用激光共聚焦扫描显微镜进行深入研究。
结论：
1.PRC17可能存在多种结合蛋白；
2.β微管蛋白可能是PRC17的结合蛋白。