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两栖类是一类具有生态、科研、经济,以及文化价值的自然资源。地球上拥有丰富的两栖类动物资源,它们是生物资源的重要组成部分,也是人类的宝贵财富。两栖类动物被广泛运用于医药、食用及观赏等,其皮肤组织中含有大量复杂多样的生物活性物质,具有极高的科研价值和利用价值,是急待于开发的资源宝库.近年来,从两栖动物皮肤分泌液中发现了大量的结构新颖,功能独特的生物活性多肽,如蛋白酶抑制剂、抗茵肽、抗氧化肽以及凝集素等。其中两栖动物皮肤中以丝氨酸蛋白酶抑制剂占多数(根据蛋白酶活性位点的特异残基,蛋白酶抑制剂被分为四类:天冬氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂)。
以南美特有的圆眼珍珠蛙为研究对象,构建了其皮肤的cDNA文库,随机挑选文库单菌落进行测序。筛选到两个候选基因Y1-2、Y3-34.再NCBI蛋白质数据库中进行BLAST比对,Y1-2蛋白质一级结构与胰蛋白酶抑制剂(Aedes aegypti)有44％的同源性,Y3-34与红细胞凝集素(Xenopus tropicalis)有53%的同源性。而且它们与同源蛋白的半胱氨酸位置和数量一致。
我们利用大肠杆菌pET表达系统成功地对有Y1-2进行了表达,通过分子筛Sephadex G50和反向高压液相(RP-HPLC)纯化步骤,获得了具有胰蛋白酶抑制剂活性的表达蛋白。MALDI-TOF测定该表达产物分子量为6160.0273 Da,与理论预测相吻合。以发色底物B3133进行酶动力学反应,测定该蛋白的蛋白酶抑制常数Ki为16.5178μM。