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海藻糖(Trehalose,α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside)是由两个葡萄糖分子经半缩醛羟基结合而成的非还原性双糖,其具有的独特生物学特性可以保护生物大分子抵抗不良的环境压力。近年来,其广泛的应用前景引起了各国科学家对其研究的极大兴趣。
本课题目的为克隆出产海藻糖合酶的目的基因片段。利用16SrRNA方法进行了菌种鉴定,同时还研究了一部分菌体提取性质:不同细胞破壁方式的比较;海藻糖合酶的保存稳定性;影响麦芽糖转化率因素的研究。实验过程中采用了快速提取细菌全基因、PCR扩增技术、电泳纯化回收基因片段、EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切鉴定目的基因片段等方法。利用16SrRNA方法进行菌种鉴定,结果菌株16SrRNA基因扩增产物共计1490个碱基;通过生理、形态、结构特征分析及16SrRNA基因全序列比较得出结论:筛选到一株枯草芽孢杆菌。
在菌悬液中加入不同的破壁试剂,作用一段时间,测定其酶活力,确定了九种破壁方式中的最佳方式。将处理好的酶液分别置于不同温度,观察酶活力变化规律。研究影响麦芽糖转化率的因素,得出结论:底物麦芽糖浓度对转化率影响很微弱,反应转速对麦芽糖转化率有较大影响。
PCR方法扩增出大约1700bp的目的基因片段。PCR扩增产物送公司测序,结果显示:该片段长1738bp(其中3’和5’端分别含设计的限制性内切酶及保护碱基各8bp),基因全长1722bp,含起始密码和终止密码,为一完整的阅读框架。利用生物软件DNAman分析推导SH-110海藻糖合酶的氨基酸排列顺序,并把SH-110与其它菌株海藻糖合酶氨基酸序列做比较,均具有较高的同源性。