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母猪子宫内膜炎是指母猪子宫黏膜的粘液性或化脓性炎症,可造成母猪发情异常,是造成规模化养猪生产中母猪高淘汰率的最重要疾病之一,给养猪业造成巨大损失。有调查显示,在养猪业中,患有子宫内膜炎的分娩母猪高达20%。子宫内膜炎主要由病毒、细菌及寄生虫等引起。目前,对子宫内膜炎的治疗主要采用抗生素、中药、生物制剂等进行治疗,虽然具有较好的效果,但是,以上治疗方法并不能彻底治疗该病,且存在一定的副作用,严重影响患畜病后的繁殖能力。因此,对于家畜子宫内膜炎,应该防重于治,在弄清其发病机制的基础上,采取更加有效的防治手段,最终使该病得到有效控制。雌激素主要成分是17β-雌二醇(17β-E2),子宫是雌激素作用的重要靶器官。研究表明,多种子宫疾病均与雌激素有密切联系,雌激素分泌情况的异常通常会导致某些子宫疾病。国内外研究证明,雌激素可以调节子宫内膜炎。本实验利用体外培养的猪子宫内膜上皮细胞,探究17β-E2对母猪子宫内膜上皮细胞炎性因子的调控机制。其主要目标为:(1)?体外培养并纯化猪子宫内膜上皮细胞;(2)建立在体外条件下猪子宫内膜上皮细胞的炎症模型;(3)探究17β-E2对子宫内膜上皮细胞NO、TNF-α、IL-1表达的调控作用;(4)探究雌激素α受体拮抗剂在17β-E2调控子宫内膜上皮细胞炎性因子表达过程中的作用;(5)探究JNK信号通路在17β-E2调控子宫内膜上皮细胞炎性因子表达过程中的作用。研究如下:(1)实验选取健康母猪正常子宫,将其子宫内膜剥离,进行原代培养、纯化和传代培养,最终获得体外子宫内膜上皮细胞,经过角蛋白免疫荧光染色鉴定,子宫内膜上皮细胞的纯化率达95%以上,为后续研究提供了高纯度、符合要求的细胞;(2)为了探究制备猪子宫内膜上皮细胞炎症模型需要的LPS剂量,实验选取1μg/mL,10μg/mL,100μg/mL的脂多糖刺激体外培养的子宫内膜上皮细胞12h。通过MTT试验测定细胞的活性,并通过NO试剂盒、ELISA、RT-PCR方法检测细胞培养液中NO、TNF-α、IL-1和NOS、TNF-α、IL-1的mRNA的表达量。结果显示,10μg/mL的LPS能显著提高子宫内膜上皮细胞的活性且能增加NO、TNF-α、IL-1和NOS、TNF-α、IL-1的mRNA的表达量,与对照组相比,差异显著(P<0.05);LPS的浓度和炎性因子的分泌量呈剂量相关性,但由于100μg/mL的LPS显著降低了细胞活性,因此后期实验选取10μg/mL的LPS对子宫内膜上皮细胞进行刺激,制作炎症模型;(3)为了探究17β-E2对子宫内膜上皮细胞炎性因子的影响,采用10μg/mL的LPS刺激子宫内膜上皮细胞12h后,分别选取10-6M,10-7M,10-8M的17β-E2处理激发培养的子宫内膜上皮细胞,通过NO试剂盒、荧光定量PCR和ELISA分别检测在2h、6?h、12?h、24?h的NO、TNF-α、IL-1和NOS、TNF-α、IL-1的mRNA表达水平。结果显示,三种浓度的17β-E2均不同程度的降低了炎性因子的表达量,且这种降低程度与17β-E2的浓度呈正比。(4)为了探究雌激素受体α在17β-E2调控子宫内膜上皮细胞炎性因子中的作用,实验用10μg/mL LPS激发培养12h后,加入含浓度为10-6M 17β-E2、10-6M17β-E2+三氧苯胺(TAM)的培养液,继续培养24h,通过NO试剂盒、ELISA、荧光定量PCR检测NO、NOS、TNF-α、IL-1的表达水平。结果发现,LPS+17β-E2组炎性因子的分泌显著降低,而LPS+17β-E2+TAM组炎性因子的分泌与LPS+17β-E2组差异显著,与LPS组差异不显著,表明雌激素受体α在17β-E2调节炎性因子表达过程中发挥了重要作用。(5)为了了解JNK信号转导通路在17β-E2对子宫内膜细胞炎性因子调节过程中的作用,实验测定了LPS组、LPS+17β-E2组以及LPS+TAM+17β-E2的P-JNK和JNK蛋白的表达量,发现LPS组的P-JNK水平显著提高,而加入17β-E2后则显著降低了P-JNK的表达水平,加入TAM后P-JNK的蛋白表达量比LPS+17β-E2组显著提高,与LPS组无显著差异。表明雌激素可能通过与雌激素受体α作用,抑制JNK路径,从而抑制LPS刺激下的细胞因子的表达。综上所述,该实验可以得到以下结论:1.本实验成功培养了猪子宫内膜上皮细胞并建立了该细胞炎症模型。2.雌激素可抑制LPS引起的子宫内膜上皮细胞的炎性因子的NO、TNF-α、IL-1分泌和NOS、TNF-α、IL-1 mRNA的表达。3.雌激素通过与子宫内膜上皮细胞上的受体α结合,抑制NO、TNF-α、IL-1的分泌和NOS、TNF-α、IL-1 mRNA的表达。4.雌激素通过与雌激素受体α作用,可能经过抑制JNK路径,从而抑制LPS刺激下的细胞因子的表达。