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Sar1(secretion-associatedandRas-related)在COPⅡ(coatproteincomplex)型有被小泡的被膜蛋白复合体的组装过程中起着分子开关的调控作用。在人上研究发现Sar1b在调控细胞内乳糜微粒从线粒体向高尔基体的转运起着重要作用,而且Sar1b基因内部碱基的突变与一些脂肪吸收紊乱症相关。该研究将其作为影响猪脂肪沉积的候选基因进行研究,通过对其克隆、染色体定位、组织表达谱分析、原核表达、多态位点检测及其与性状的关联分析,为进一步研究该基因影响猪脂肪沉积的作用打下基础,并为其将来应用于分子标记辅助选择育种提供分子遗传基础。主要研究结果如下:
1.依据人Sar1b基因cDNA信息,通过由生物信息学及比较基因组学的策略获得的猪EST重叠群设计的猪特异引物克隆出猪Sar1b基因cDNA编码区全长序列,该序列与人和小鼠的相应序列的同源性分别为93%和91%,已经提交到GenBank,获得的基因收录号为AY819557。
2.利用体细胞杂交板对猪Sar1b基因进行了染色体区域定位。将PCR分型数据提交到在线数据分析软件进行统计分析,结果表明该基因被定位于猪2号染色体上,区域定位结果为SSC2(1/2q24)-q29(P=0.8696,相关系数为1,错误风险值低于0.5%)。
3.利用辐射杂交板对猪Sar1b基因进行了染色体精细定位。将PCR分型数据提交到在线数据分析软件进行统计分析,结果表明该基因与IL4基因紧密连锁(LOD=8.37),并且紧密连锁的微卫星标记为SW1879(LOD=6.68)。
4.以鄂西黑猪的肝、小肠、胃、心、肺、脾、肌肉及脂肪组织为材料,利用半定量RT-PCR检测了猪Sar1b基因的组织表达谱,结果发现该基因在上述八个组织中均表达,但在脂肪和肝脏中表达量相对较高。
5.构建了猪Sar1b基因重组原核表达载体pET28a-Sar1b,利用SDS-PAGE及Western-blot检测出该重组原核表达载体成功表达出了猪Sar1b蛋白。
6.应用PCR-SSCP的方法在分离的猪Sar1b基因的3’非翻译区(UTR)中距离终止密码子最后一个碱基为7bp的位置检测了一个碱基缺失突变位点。分析了不同群体中这个碱基缺失突变位点的多态性,计算了这个位点的基因型和基因频率,比较了各基因型在不同猪群的分布差异。
7.在研究中与通城县畜牧局共同组建的试验群体中的通城、大长通和长大通中检测了Sar1b基因3’非翻译区的缺失突变位点的多态性,利用SAS8.2中的广义线型模型分析了该基因与部分生产性状的关联,初步的分析结果表明该基因3’非翻译区的缺失突变位点与猪肌肉pH值显著相关(P=0.04),最小二乘均数的两两比较发现AA基因型个体的肌肉pH值显著高于AB基因型的个体(P=0.012)。