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目的：通过实验研究,阐明酸枣仁皂苷A的改善果蝇睡眠作用及其作用机制。方法：第一部分基于果蝇模式生物的酸枣仁皂苷A改善睡眠作用的研究一、酸枣仁皂苷A对7日龄野生型CS品系黑腹果蝇睡眠时间和睡眠-觉醒节律的影响研究选取7日龄野生型C S品系黑腹果蝇,随机分为空白组,酸枣仁皂苷A组(JA组),地西泮组(DZ组),利用DAMS果蝇活动监测系统的监测方法,以睡眠时间、睡眠时间延长率和睡眠-觉醒节律图为观察指标,探讨酸枣仁皂苷A对7日龄野生型CS品系黑腹果蝇睡眠时间和睡眠-觉醒节律的影响。二、酸枣仁皂苷A对7日龄野生型CS品系黑腹果蝇睡眠时间和睡眠-觉醒节律的量效关系研究选取7日龄野生型CS品系黑腹果蝇,随机分为0.25、0.5、1、2、4mg/ml剂量组,利用DAMS果蝇活动监测系统的监测方法,以睡眠时间、睡眠时间延长率和睡眠-觉醒节律图为观察指标,探讨酸枣仁皂苷A对7日龄野生型CS品系黑腹果蝇睡眠时间和睡眠-觉醒节律影响的量效关系。三、酸枣仁皂苷A对7日龄野生型CS品系黑腹果蝇睡眠时间和睡眠-觉醒节律的时效关系研究选取野生型CS品系黑腹果蝇,按照量效关系中的最佳给药剂量1 mg/ml给药,分别给药1、2、3、4、5、6天,利用DAMS果蝇活动监测系统的监测方法,以睡眠时间、睡眠时间延长率和睡眠-觉醒节律图为观察指标,探讨酸枣仁皂苷A对野生型CS品系黑腹果蝇睡眠时间和睡眠-觉醒节律影响的时效关系。第二部分酸枣仁皂苷A对机械性剥夺睡眠7日龄果蝇24小时睡眠时间和睡眠-觉醒节律的影响选取野生型CS品系7日龄黑腹果蝇,随机分为空白组,SNAS组,JA组,利用SNAS机械性睡眠剥夺装置和DAMS果蝇活动监测系统,进行睡眠剥夺模型的复制,并以睡眠时间,睡眠时间延长率和睡眠-觉醒节律图为观察指标,探讨酸枣仁皂苷A对机械刺激睡眠剥夺果蝇24小时睡眠时间和睡眠觉醒节律的影响。第三部分 酸枣仁皂苷A改善果蝇睡眠作用的机制研究一、酸枣仁皂苷A对果蝇头部神经递质5-HT,D A和GABA含量的影响选取野生型C S品系7日龄黑腹果蝇,随机分为空白组,SNAS组,J A组,利用酶联免疫测定技术(ELISA),以果蝇头部的5.HT,DA和GABA为观察指标,研究酸枣仁皂苷A对果蝇头部神经递质的含量变化影响。二、基于5-HT系统的酸枣仁皂苷A改善果蝇睡眠作用的机制研究选取野生型CS品系7日龄黑腹果蝇,随机分为空白组,MEP组,JA+MEP组。利用DAMS果蝇活动监测系统,以睡眠时间,睡眠时间延长率和睡眠-觉醒节律图为观察指标,探讨5-HT受体拮抗剂甲替平对果蝇睡眠及睡眠-觉醒节律的影响及药物的干预作用。三、基于Gsα-cAMP-pka信号通路的酸枣仁改善果蝇睡眠作用的机制研究选取野生型CS品系7日龄黑腹果蝇,随机分为空白组,SNAS组,JA组,采用Real-time PCR法检测cDNA样本中GSα、AC、PKA三个基因相对表达量第四部分酸枣仁皂苷A对Gsα基因敲除果蝇的睡眠时间和睡眠-觉醒节律的影响研究选取野生型CS品系7日龄黑腹果蝇和Gsα基因敲除果蝇,分为野生型组,Gsa敲除组,JA组,利用DAMS果蝇活动监测系统,以睡眠时间和睡眠觉醒节律图为观察指标,探讨Gsα基因敲除果蝇的睡眠时间和睡眠-觉醒节律,以及酸枣仁皂苷A对Gsα基因敲除果蝇睡眠时间和睡眠-觉醒节律的影响。结果：第一部分基于果蝇模式生物的酸枣仁皂苷A改善果蝇睡眠作用的研究一、酸枣仁皂苷A对7日龄野生型CS品系黑腹果蝇睡眠时间和睡眠-觉醒节律的影响研究实验结果表明：与空白组比较,JA组DAST延长,两者间比较具有显著性差异(p<0.05),AST和NAST均延长,两者间比较具有极显著性差异(p<0.01)。与空白组比较DZ组AST、DAST、NAST均延长,两者间比较具有极显著性差异(p<0.01)。与DZ组比较,JA组AST减少,两者间比较具有极显著性差异(p<0.01),DAST减少,两者间比较具有显著性差异(p<0.05),NAST无显著性差异。睡眠-觉醒节律图显示：空白组果蝇睡眠-觉醒节律的特点是白天夜晚均有睡眠,睡眠主要集中在夜间,睡眠呈片段化,24h明暗交替处出现活动高峰。与空白组比较,JA组白天和夜晚睡眠仍呈现片段化,白天活动减少,睡眠的时间增加。与空白组比较,DZ组果蝇白天和夜晚的活动均减少,尤其以夜晚出现长时间持续的睡眠状态。与DZ组比较,JA组白天和夜晚睡眠时间减少,在19：00明暗交替处的活动高峰明显。二、酸枣仁皂苷A对7日龄野生型C S品系黑腹果蝇睡眠时间和睡眠-觉醒节律的量效关系研究实验结果表明：与空白组比较,0.25mg/mL～2mg/mL给药浓度的酸枣仁皂苷A,AST均有所延长,并有极显著性差异(p<0.01),NAST均有所延长,当给药浓度达到1mg/mL时,AST,DA ST,NAST均有所延长并有极显著性差异(p<0.01)。与空白组比较,酸枣仁皂苷A为1mg/ml时果蝇睡眠时间延长率均最高。睡眠-觉醒节律图显示：与空白组比较,0.25mg/ml组果蝇夜晚的活动减少,睡眠时间增加；0.5mg/ml组果蝇果蝇的连续活动减少,白天和夜晚的睡眠时间增加；1mg/ml组果蝇连续活动明显减少,白天和夜晚睡眠时间均增加；2mg/ml组果蝇白天和夜晚的睡眠时间增加,睡眠片段化明显；4mg/ml组果蝇白天和夜晚睡眠呈片段化,与空白组没有明显的差异。三、酸枣仁皂苷A对7日龄野生型C S品系黑腹果蝇睡眠时间和睡眠-觉醒节律的时效关系研究实验结果表明：与空白组比较,2d组果蝇的AST,NAST延长(p<0.01),DAST延长(p<0.05)。3 d组AST,NAST,DAST均延长,均有极显著性差异(p<0.01)。4d组AST,DAST和NAST均缩短。与空白组比较,3 d组睡眠时间延长率最高。睡眠-觉醒节律图显示：与空白组比较,给药1d组,果蝇白天睡眠不连续,夜间睡眠较集中,睡眠时间没有较大差异；给药2d组,果蝇白天睡眠时间增加,夜间睡眠没有较大差异；给药3d组,白天和夜晚活动均减少,睡眠时间均延长；给药4d组和给药5d组,果蝇白天持续活动,夜晚睡眠时间增加,活动减少；给药6d组,果蝇白天和夜晚的睡眠呈片段化,19：00明暗交替处活动高峰明显。第二部分酸枣仁皂苷A对机械性剥夺睡眠7日龄果蝇241小睡眠时间和睡眠-觉醒节律的影响实验结果表明：与空白组比较,SNAS组AST减少,NAST减少,均具有极显著性差异(P<0.01)。与SNAS组比较,JA组AST增加,NAST增加,均具有极显著性差异(P<0.01)。睡眠-觉醒节律图显示：与空白组比较,SNAS组夜间睡眠明显减少,睡眠呈片段化,且活动时间增加。7：00后出现集中的睡眠反弹现象,睡眠的节律发生改变。与SNAS组比较,JA组白天的睡眠时间增加,夜晚活动减少,睡眠时间增加,7：00后仍出现集中的睡眠反弹现象。第三部分酸枣仁皂苷A改善果蝇睡眠作用的机制研究一、酸枣仁皂苷A对果蝇头部神经递质5-HT, DA和GABA含量的影响实验结果表明：1.与空白组比较,SNAS组5-HT含量降低(p<0.05),与SNAS组比较,J A组5-H T含量明显升高,2.与空白组比较,SNAS组D A含量显著降低(p<0.01),与SNAS组比较,J A组果蝇脑内D A含量无显著性差异。3.与空白组比较,SNAS组GABA含量显著降低(p<0.0 1),与SNAS组比较,J A组GABA含量无显著性差异。二、基于5。HT系统的酸枣仁皂苷A改善果蝇睡眠作用的机制研究实验结果表明：与空白组比较,SNAS组A S T减少(P<0.01),NAST减少(P<0.01),均具有极显著性差异。与空白组比较,MEP组均没有显著性差异。SNAS组7：00后出现集中的睡眠反弹现象。睡眠的节律发生变化。MEP组睡眠-觉醒的节律不明显。与MEP组比较,JA+MEP组AST增加,有显著性差异(P<0.05)。三、基于Gsα-cAMP-pka信号通路的酸枣仁改善果蝇睡眠作用的机制研究实验结果表明：与空白组比较,SNAS组GSα、AC、PKA的基因相对表达量升高,JA组与SNAS组比较,GSα、AC、PKA三个基因相对表达量均降低。第四部分酸枣仁皂苷A对Gsα基因敲除果蝇的睡眠时间和睡眠觉醒节律的影晌研究实验结果表明：与野生型比较,Gsa敲除组AST,DAST,NAST,均无显著性差异。与Gsα敲除组比较,JA组AST增加,DAST增加,两者间比较均具有极显著性差异(P<0.01)。睡眠-觉醒节律图显示：与野生型比较,白天和夜晚均有睡眠,睡眠呈片段化,明暗交替无明显的活动高峰,睡眠-觉醒节律不明显。与Gsa敲除组比较,JA组白天活动减少,睡眠时间延长。19：0 0左右出现集中活动的情况,出现节律的变化。结论：酸枣仁皂苷A的改善果蝇睡眠的作用最佳给药剂量1mg/ml,最佳给药天数为3天,其影响的作用机制与果蝇头部的神经递质5-HT含量有关,并影响与其特异性结合的G蛋白偶联受体引发突触后细胞发生反应并产生相关信号,通过Gsα-cAMP-pka信号通路发挥调控作用的,并可能与该通路编码的关键基因Gsa基因表达量有关。