【摘 要】
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蛋白质作为生命活动的体现者,在生物体中发挥着重要的作用。21世纪是生物的时代,随着生物技术的迅猛发展,各种理论和技术的不断革新,但在蛋白质领域内还是存在一些令人棘手的
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蛋白质作为生命活动的体现者,在生物体中发挥着重要的作用。21世纪是生物的时代,随着生物技术的迅猛发展,各种理论和技术的不断革新,但在蛋白质领域内还是存在一些令人棘手的问题。如表达产量低,包涵体形成,稳定性低,难以结晶等等。因此,很多研究者针对这些问题,提出了相应的解决办法。比如加入合适的标签小分子泛素(SUMO)用来促融,加入绿色荧光蛋白(GFP)标签用来定位等等。天冬氨酸转氨甲酰酶(Aspartate Carbamoyltransferase),简称ATCase,其全酶由形成二聚体的调节亚基和形成三聚体的催化亚基两部分组成。催化亚基和调节亚基相互作用,形成一个完整的,形似“花瓣”的异源十二聚体。本研究利用大肠杆菌ATCase的调节亚基可形成二聚体,全酶可形成十二聚体的性质,设计了一种新的融合表达载体,插入目的蛋白进行表达后,可以使目的蛋白形成不同形式的聚集体,这种新载体命名为p ET-15b-SUMO-ATC。同时以端粒酶TERT为例,用动态光散射技术(DLS),凝胶过滤层析(SEC)和小角散射(SAXS)实验对融合蛋白的聚集状态进行了分析验证,主要获得了以下结果:1.利用新设计的表达载体纯化得到了高纯度的融合蛋白ATC-TERT。利用动态激光散射(DLS)技术,凝胶过滤层析(SEC)技术证明融合蛋白成功形成了二聚体。另外,体外延伸实验和小角散射(SAXS)实验补充证明了本研究中的融合蛋白有活性且可以正确折叠。2.为了探讨我们表达的融合蛋白与ATCase的催化亚基(ATC-SC)是否也能在体外形成十二聚体,我们将含有调节亚基的ATC-TERT融合蛋白与ATC-SC在适宜的体外条件下进行复合,发现两个蛋白也能成功形成十二聚体。3.为了进一步验证融合表达载体表达的蛋白的性质具有普遍性,利用实验室已有的解旋酶De Pif1和解旋酶DDX系列蛋白同样进行分析。结果证明相关蛋白均可以形成相应的二聚体和十二聚体。4.本研究证明通过新构建的融合表达载体能改变目的蛋白的聚集形式却不影响它们的原始折叠状态和基本活性,因而能获得适用于冷冻电镜观察的大小合适的目的蛋白;另外,通过使蛋白形成聚体,也可以提高一些小蛋白的稳定性。
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