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第一部分Livin在急性白血病的表达和临床意义【目的】检测livin mRNA在急性白血病(AL)患者和正常人中的表达情况,观察livin在急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)和正常人的表达差异,并分析探讨livin表达与AL的诱导化疗完全缓解率(CR)的关系。【方法】随机选择50例符合FAB诊断标准的初发AL患者,采集其骨髓或外周血(幼稚细胞较高时)单个核细胞,提取总mRNA,用RT-PCR法检测患者化疗前和6例正常对照者的livin mRNA表达水平,并对所得结果进行统计学分析,比较livin在ALL与ANLL之间、ALL和ANLL与正常人之间表达有无显著差异性。收集患者临床资料,分析其诱导化疗效果及其与livin表达的关系。【结果】在正常人中,livin mRNA表达阳性率仅为16.7%。50例AL患者中41例livin mRNA表达阳性(82.0%)。19例ALL患者中17例细胞livin mRNA表达阳性( 89.4%)。31例ANLL患者中24例livin mRNA表达阳性(77.4%)。在ALL和ANLL细胞中, livin mRNA表达阳性率均明显高于正常对照组(P值均<0.01)。Livin的表达水平与AL诱导化疗CR率成负相关。特别在急性淋巴细胞性白血病中,livin表达上调的病例其诱导化疗缓解率(CR率)较低。【结论】Livin在多数急性白血病患者中表达上调,livin在ALL中的高表达提示诱导缓解率较低。Livin可以作为判断ALL预后的新指标,并有可能成为白血病基因治疗的新靶点。第二部分RNA干扰技术沉默K562细胞livin基因的实验研究【目的】观察小分子RNA干扰技术下调高表达livin的白血病细胞系K562细胞livin基因表达后, K562细胞的自发凋亡率及K562细胞对化疗药物敏感性的变化,并初步探讨其诱导凋亡和增加药物敏感性的分子机制。【方法】K562细胞常规条件下培养至细胞对数生长期;根据siRNA设计原则,设计三条针对livin基因的特异干扰序列;化学合成livin基因siRNA及阴性对照(si-neg) ,核转染K562细胞;通过RT-PCR分析转染前后K562细胞livin mRNA的表达情况;通过Western Blot检测转染前后K562细胞livin蛋白的表达;利用流式细胞仪进行细胞凋亡的分析,观察转染及药物VP-16对K562的诱导凋亡作用;MTT法检测K562细胞转染前后对VP-16的敏感性变化;利用酶标仪检测转染前后K562细胞Caspase-3的活性变化。【结果】①三条siRNA都能在转录后水平下调livin mRNA的表达,并进而降低livin蛋白的表达水平;其中以第三条序列的基因沉默效果最明显。②以siRNA-3为转染序列,K562细胞转染后48小时自发凋亡率为27.41±0.31%,与未转染组的9.63±0.08%相比,有明显提高(P<0.05);未转染组,转染组,单加VP-16组,VP-16和转染联合作用组48小时的凋亡率分别为9.6±0.11%、27.7±0.30%、31.4±0.29%、45.1±0.49%;③转染siRNA-3后,VP-16对K562细胞的半数致死量(IC50)由转染前的10μmol/L下降至5μmol/L;④Caspase-3的活性在转染siRNA-3前后分别为100%和145%。【结论】RNA干扰技术可以在mRNA水平下调K562细胞livin基因表达,进而影响蛋白的表达。沉默livin基因可以增加K562细胞对化疗药物的敏感性。Livin表达降低后,Caspase-3活性的提高可能是K562细胞凋亡增加和药物敏感性提高的机制之一。针对livin基因设计的特异siRNA序列可望成为白血病基因治疗的新手段。